張靜雯 董玲鳳 黃建洲 范樹明 冼卓杰

在輔助生殖實驗室技術(shù)中, 胚胎在發(fā)育過程中所處的微環(huán)境對胚胎發(fā)育質(zhì)量至關(guān)重要, 胚胎培養(yǎng)微環(huán)境的主要構(gòu)成包括培養(yǎng)基、氣體環(huán)境和培養(yǎng)模式［1］。本文采用兩種囊胚模式培養(yǎng), 分析不同培養(yǎng)模式的利弊, 為進(jìn)一步提高胚胎體外發(fā)育潛能尋找最適合的培養(yǎng)模式。具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014～2017年在佛山市婦幼保健院生殖中心行常規(guī)IVF治療的433例不孕患者, 第一取卵周期、促排卵方案均為長方案、常規(guī)IVF、進(jìn)行囊胚培養(yǎng)且每囊胚培養(yǎng)周期中胚胎培養(yǎng)數(shù)目≥5枚, 其中優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎比例≥20%。根據(jù)囊胚培養(yǎng)方式不同分為對照組(58例)和研究組(375例)。對照組患者年齡26～34歲, 平均年齡(30.0±3.4)歲。研究組患者年齡26～33歲, 平均年齡(29.5±3.2)歲。兩組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05), 具有可比性。

1.2 方法 將取卵日定為D0天, 根據(jù)D3天進(jìn)行囊胚培養(yǎng)的體外培養(yǎng)模式分成單胚胎培養(yǎng)和胚胎集合培養(yǎng)。用于進(jìn)行囊胚培養(yǎng)的培養(yǎng)皿提前1 d下午制作, 均以囊胚培養(yǎng)液(G2, 瑞典Vitrolife公司)在每個Falcon353001培養(yǎng)皿內(nèi)制作7個30μl的微滴, 微滴上覆蓋石蠟培養(yǎng)油(瑞典Vitrolife公司),制備成囊胚期培養(yǎng)皿(BM)。對照組采用單胚胎微滴培養(yǎng), 將每1枚待培養(yǎng)的卵裂期胚胎按預(yù)定編號逐一從卵裂期培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至囊胚期培養(yǎng)皿內(nèi)；研究組采用胚胎集合微滴培養(yǎng), 將待培養(yǎng)的卵裂期胚胎按預(yù)定分組將每2～5枚胚胎按組從卵裂期培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至囊胚期培養(yǎng)皿, 即每微滴胚胎數(shù)為2～5枚。所有囊胚培養(yǎng)胚胎均置為型號K-MINC-1000的COOK混合氣體培養(yǎng)箱(美國COOK公司)。

常規(guī)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)后囊胚培養(yǎng)及囊胚分級 取卵后行常規(guī)IVF, 受精后平均(18±1)h進(jìn)行脫顆粒操作并觀察受精情況, 出現(xiàn)雙原核(2PN)為正常受精。于D3天選擇移植或冷凍后剩余的受精正常且卵裂球數(shù)≥4細(xì)胞、細(xì)胞大小及碎片評分在1～3級的胚胎, 經(jīng)過G2培養(yǎng)液輕柔沖洗后轉(zhuǎn)入相應(yīng)BM皿培養(yǎng)微滴置COOK箱進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。于D5、D6天分別按照Gardner囊胚分級法對形成的囊胚進(jìn)行分級［2］。將D5、D6天囊胚擴(kuò)張和孵出程度分級為≥3級、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass, ICM)和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞(trophectoderm, TE)分級不同時為C級(即AA、AB、AC、BA、BB、BC、CA、CB)的囊胚進(jìn)行冷凍或移植。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 比較兩組患者囊胚培養(yǎng)結(jié)果,包括可利用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、形成可利用囊胚周期率［即：獲得可利用囊胚移植和(或)冷凍的周期數(shù)占總養(yǎng)囊周期數(shù)的比例)、形成優(yōu)質(zhì)囊胚周期率［即：獲得優(yōu)質(zhì)囊胚移植和(或)冷凍的周期數(shù)占總養(yǎng)囊周期數(shù)的比例］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

研究組可利用囊胚形成率54.43%、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率30.69%、形成可利用囊胚周期率98.40%、形成優(yōu)質(zhì)囊胚周期率85.60%均高于對照組的48.04%、24.86%、93.10%、74.14%, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或＜0.05)。見表1。

表1 兩組患者囊胚培養(yǎng)結(jié)果比較(%)

3 討論

本文模仿時差技術(shù)的培養(yǎng)模式, 研究時差技術(shù)中胚胎集合培養(yǎng)與傳統(tǒng)的單一胚胎培養(yǎng)模式對囊胚發(fā)育的影響。研究結(jié)果顯示, 研究組可利用囊胚形成率54.43%、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率30.69%、形成可利用囊胚周期率98.40%、形成優(yōu)質(zhì)囊胚周期率85.60%均高于對照組的48.04%、24.86%、93.10%、74.14%, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或＜0.05)。由此證實胚胎自分泌或者旁分泌所產(chǎn)生的有益因子因多個胚胎聚集培養(yǎng)使其濃度增加而可能有助于胚胎的生長發(fā)育。但是由于胚胎培養(yǎng)過程中雖能產(chǎn)生利于維持胚胎發(fā)育穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)生長發(fā)育的有益因子, 但也同時生成一些可能存在負(fù)作用的代謝產(chǎn)物,群組培養(yǎng)有益因子濃度增加的同時可能阻礙或損害胚胎發(fā)育的代謝產(chǎn)物的濃度也同樣增加［3,4］。

雖然本研究結(jié)果表明在囊胚培養(yǎng)中采用胚胎集合微滴培養(yǎng)模式有助于獲得更好的囊胚培養(yǎng)效果。但是由于本研究所采用的培養(yǎng)皿為普通培養(yǎng)皿, 進(jìn)行集合培養(yǎng)過程中培養(yǎng)皿的移動會導(dǎo)致同一個微滴內(nèi)的數(shù)個胚胎位置發(fā)生變動, 不利于每一枚胚胎的持續(xù)追蹤, 無法如單胚胎培養(yǎng)一樣在臨床治療中的胚胎觀察與評價方面存在優(yōu)勢［5,6］。因此, 下一步的研究方向是利用微孔(WOW)培養(yǎng)法的理念, 使用商品化的Primo Vision新型胚胎培養(yǎng)皿進(jìn)行集合培養(yǎng), 從而使單胚胎培養(yǎng)便于胚胎持續(xù)性跟蹤與集合胚胎培養(yǎng)的聚集培養(yǎng)優(yōu)勢得到較好的利用, 改善傳統(tǒng)集合胚胎的模式, 進(jìn)行新型集合胚胎培養(yǎng)與單胚胎培養(yǎng)在臨床結(jié)局方面的對比［7-10］。

綜上所述, 在囊胚培養(yǎng)方面, 胚胎集合微滴培養(yǎng)較單胚胎微滴培養(yǎng)有明顯優(yōu)勢。