覃羽華

【關(guān)鍵詞】 白假絲酵母菌;檢測技術(shù);基因分型;質(zhì)譜

中圖分類號：R446.5 ? ?文獻標志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.05.017

白假絲酵母菌（candida albicans）俗稱白色念珠菌，在一定條件下可侵犯皮膚、黏膜、內(nèi)臟和血液，引起繼發(fā)性感染，表現(xiàn)為急性、亞急性或慢性炎癥。近年來，醫(yī)學診斷和治療技術(shù)的迅猛發(fā)展，使得各種危重癥患者的病死率有所下降，與此同時各種新醫(yī)療技術(shù)越來越多地被應用，以及免疫缺陷患者增多，人口老齡化日益加劇，條件致病性真菌引發(fā)的深部真菌性疾病發(fā)生率愈來愈高，嚴重威脅著患者的身體健康和生命安全，受到醫(yī)學界的高度重視[1]。對人類致病的深部真菌病原菌主要有假絲酵母菌屬、酵母菌屬以及曲霉菌屬，其中，白假絲酵母菌引起的真菌感染是最常見的一種，有研究表明，在亞洲白假絲酵母菌引起深部真菌病的病死率高達30.0%左右[2]。以往針對白假絲酵母菌傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)研究方法，如形態(tài)學法、生物學法、組織發(fā)生學法、血清學法以及藥敏譜類型分析等存在區(qū)分率較低，易受外環(huán)境影響，重復性、精準性較差的缺點，已不能對其進行更深入而有效的分析與研究。目前，隨著生命科學及醫(yī)療科技的發(fā)展，以PCR為基本原理的分子生物學技術(shù)以及更高端精準的微生物質(zhì)譜分析技術(shù)已逐步應用于醫(yī)學研究領(lǐng)域，解決了一些傳統(tǒng)檢測技術(shù)不能解決的問題。現(xiàn)將白假絲酵母菌臨床檢測及分型技術(shù)的研究進展綜述如下。

1 白假絲酵母菌檢測技術(shù)

白假絲酵母菌的基本檢測技術(shù)包括培養(yǎng)方法和非培養(yǎng)方法，培養(yǎng)方法可分為大培養(yǎng)和小培養(yǎng)兩種;非培養(yǎng)方法則包括：顯微鏡檢查、抗原抗體和特異性代謝產(chǎn)物檢測、細胞壁成分檢測、核酸檢測以及質(zhì)譜分析儀檢測。由于非培養(yǎng)方法在靈敏度或特異性上存在一定缺陷，因此其始終不能完全代替培養(yǎng)鑒定方法。

1.1 顯微鏡直接鏡檢技術(shù) 直接鏡檢技術(shù)是檢測白假絲酵母菌感染最基本的檢驗方法之一，其優(yōu)點是不需要特殊的設備和試劑，容易開展，即簡便、快速而且實用。直接鏡檢存在的缺點是主觀因素導致假陰性或假陽性結(jié)果，陰性結(jié)果并不能排除白假絲酵母菌感染，陽性率相對較低，且不能直接用于菌種的鑒定[3]。不染色標本直接鏡檢：對于尿液、膿液及分泌物等標本直接取少量置載玻片上，加適量的生理鹽水混勻即可直接鏡檢，對于皮屑、毛發(fā)及指甲等標本，需進行消化處理后，可在顯微鏡下觀察孢子及菌絲體。染色標本顯微鏡檢查：白假絲酵母菌經(jīng)革蘭氏或乳酸棉酚蘭染色后，光鏡下可見染成深紫色或藍色的菌絲、孢子，熒光染色更適用于深部感染的白假絲酵母菌檢查，在熒光顯微鏡下觀察菌體成黃綠色，目前革蘭染色法在臨床上使用最為廣泛，其不受溫度影響，病原體長期固定在涂片上便于復查。

1.2 分離培養(yǎng)鑒定技術(shù) 培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定：白假絲酵母菌接種于人或動物血清中孵育后，光鏡下孢子可長出細而短的小芽管。CHROMagar顯色培養(yǎng)基上白假絲酵母菌呈現(xiàn)翠綠色。培養(yǎng)基培養(yǎng)技術(shù)可提高白假絲酵母菌的陽性檢出率，同時還可以確定其種類，但培養(yǎng)的時間較長，培養(yǎng)陽性率也較低[4]。檢測深部白假絲酵母菌感染的生化試驗方法包括：糖類發(fā)酵試驗、硝酸鹽還原試驗、尿素酶試驗。對于特殊變異的菌株，生化試驗鑒定存在一定的局限性。近年來，API 20C AUX等生化鑒定系統(tǒng)不斷被開發(fā)出來，其正確鑒定率高，鑒定范圍寬，但也存在價格昂貴，對無菌操作要求嚴格的缺點[5]。

1.3 血清學檢測技術(shù) 目前國外報道檢測白假絲酵母菌抗原的試劑普遍存在敏感性和特異性偏低的缺點，朱素梅等[6]研究結(jié)果表明該技術(shù)操作簡便、快速，靈敏度比直接顯微鏡檢測高，適合婦產(chǎn)科門診大批量標本的篩查。檢測特異性抗體及分泌蛋白酶雖然對判斷預后和流行病學調(diào)查有所幫助，但是對深部白假絲酵母菌感染的確診意義不大。檢測1，3-β-D-葡聚糖是目前比較有發(fā)展空間的診斷方法，但對感染的特異性診斷存在局限性，只能作為篩查試驗。總之，血清學檢測試驗存在一定假陰性和假陽性結(jié)果，而且檢測試劑昂貴，國內(nèi)尚未廣泛使用。

1.4 組織病理學檢測技術(shù) 通過組織或細胞化學方法在組織切片中找到病原菌-白假絲酵母菌，是確診該菌感染的金標準[7]。但病理學傳統(tǒng)的檢測技術(shù)敏感性不高，并且存在侵入性操作，有增加感染等并發(fā)癥的風險，因此不作為診斷白假絲酵母菌感染的首選方法。

1.5 動物接種實驗 動物實驗應用于白假絲酵母菌實驗室診斷的目的是分離出致病菌，確定本菌種的致病性，研究藥物對該病原菌的作用等。這種動物實驗技術(shù)操作復雜繁瑣、費時費力，目前只用于科學研究項目，并沒有在臨床工作中廣泛應用。

1.6 核酸雜交檢測技術(shù) 即用已知特定序列的標記探針與待檢測核酸片段雜交，以檢驗其是否與已知的探針具有同源序列。李田等人[8]用該技術(shù)對假絲酵母菌進行檢測，證實了核酸雜交的敏感度和特異性均高于傳統(tǒng)檢測方法，與金標準檢測方法具有較好的一致性。

2 白假絲酵母菌基因分型檢測技術(shù)

基因分型技術(shù)是以生物體DNA序列差異為基礎(chǔ)建立起來的顯示基因組多態(tài)性的檢測方法。這些分子生物學檢測技術(shù)具有敏感性高、特異性強、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，可以作為區(qū)分院內(nèi)多重感染、微生物病原體分型鑒定、種群遺傳關(guān)系和菌株間親緣關(guān)系等深入研究的技術(shù)方法。

2.1 脈沖凝膠電泳核型（PFGE）檢測技術(shù) 該技術(shù)分型能力較強，運用于大分子DNA分離具有良好的重復性和穩(wěn)定性，適用于流行病學的調(diào)查研究[9]，基于PFGE技術(shù)的核型分析（EK）技術(shù)使得具有大分子量核酸的白假絲酵母菌基因組深入研究得以進行，但此類分型技術(shù)耗時長，易受多種因素影響，不能對分子量相近的DNA進行有效分離等[10]。

2.2 多位點酶電泳（MLEE）檢測技術(shù) 通過檢測酶蛋白的多態(tài)性來反映基因位點的多態(tài)性，是白假絲酵母菌流行病學研究中應用最早的基因分型方法，MLEE具有重復性極佳的優(yōu)點[11]，但其檢測耗時較長，分型分辨率一般，且不能檢測全部基因序列，需多個酶切位點結(jié)合以提高靈敏度。

2.3 隨機引物擴增多態(tài)性（RAPD）檢測技術(shù) 該技術(shù)能揭示未知DNA序列基因組多態(tài)性的分型方法，拓寬了對基因組DNA變異領(lǐng)域的研究;能區(qū)分白假絲酵母菌的感染來源，是目前最常用的基因分型方法。應春妹等[12]認為該方法操作簡單快速，靈敏度和特異性較高，被廣泛應用于白假絲酵母菌的基因分型中。但該技術(shù)檢測結(jié)果易受實驗條件影響，存在重復性較差、難建立標準化的缺點。

2.4 限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）檢測分析技術(shù) 凡是可以引起酶切位點變異的突變?nèi)琰c突變和一段DNA的重新組織等均可以導致RFLP的產(chǎn)生。RFLP技術(shù)影響因素少，穩(wěn)定性較高，可進行菌種間和菌種內(nèi)的基因分型，用于流行病學調(diào)查。但其需要相對多的純基因組DNA，條帶分辨率低，不能完全反映出不同菌株間的差異[13]。將RFLP與其他技術(shù)（如Southernblot、PCR等）相結(jié)合，能完全地反映出不同菌株之間的差異，使分型能力得以提高[14]。

2.5 擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）檢測分析技術(shù) 是基于基因組DNA限制性片段上的PCR擴增技術(shù)。Tavanti等[15]在應用該技術(shù)分析基因型時發(fā)現(xiàn)菌株之間存在低變異性。AFLP將RFLP和PCR兩種技術(shù)有效結(jié)合，具有高效分辨率和重復可靠的優(yōu)點，是一種很好的菌株分型分析方法。但因該技術(shù)涉及專利問題，實驗成本較高，引物設計及操作技術(shù)要求嚴格，所以其應用和推廣受到了限制[16]。

2.6 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）檢測技術(shù) 利用DNA或RNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性的特點，結(jié)合PCR進行基因檢測的一種分子生物學技術(shù)，即PCR-SSCP技術(shù)，其分離出的條帶具有高特異性，且實驗操作簡單，成本較低，已成為臨床白假絲酵母菌快速分型和微進化檢測既有力又經(jīng)濟的分型方法[17]。但該技術(shù)對實驗各項條件的要求均較高，存在不能準確發(fā)現(xiàn)突變位點和類型的缺點。

2.7 DNA測序技術(shù) 即分析特定DNA片段的堿基序列。DNA測序方法是目前判斷菌株之間同源性最精確的分型方法，它的出現(xiàn)使基因圖譜可以構(gòu)建，極大地推動了生物界和醫(yī)學界的研究與發(fā)展。張志勤[18]對白假絲酵母菌CA6184的全基因組進行測序，闡明了其致病機制，為疾病的治療奠定了堅實的基礎(chǔ)。微衛(wèi)星長度多態(tài)性（MLP）檢測技術(shù)又稱短串聯(lián)重復序列（STR），是建立在DNA測序原理上發(fā)展起來的一種新的分子生物學研究技術(shù)。MLP技術(shù)具有高分辨率、高通量、自動化的優(yōu)勢，是一種新型有效的分型方法，改進后被廣泛應用于白假絲酵母菌的基因分型、親緣的鑒定、種群遺傳結(jié)構(gòu)的分析以及流行病學的研究中[19]。但由于其重復性較低，分析過程復雜且易受實驗條件影響，成本較高，因此在研究和應用范圍上受限。多位點序列分析（MLST）檢測技術(shù)是一種建立于核酸序列測定的基因分型方法，近些年發(fā)展速度較快，2003年Bougnoux建立了白假絲酵母菌MLST分型的國際標準數(shù)據(jù)庫。Wu等[20]研究證明了MLST是研究白假絲酵母菌流行病學和分子進化的有用工具。MLST研究結(jié)果準確，分辨力強，可對大量菌株進行分型，而且實驗室間的結(jié)果可以進行比對，但存在實驗成本高、耗時長的缺點。

3 質(zhì)譜檢測技術(shù)

隨著新型分子水平技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜（Mass Spectrometry，MS）技術(shù)可以對病原微生物（包括病毒、細菌、真菌及孢子、寄生生物等）進行檢測和鑒定。與傳統(tǒng)的鑒定方法相比，MS技術(shù)檢測時間短、結(jié)果準確、試劑和耗材成本較低，并能準確將假絲酵母菌鑒定到種的水平，為臨床對白假絲酵母菌感染的早期、快速診斷提供了新的技術(shù)方向[21]。國內(nèi)李艷君等[22]應用MALDI-TOF質(zhì)譜儀對酵母菌進行鑒定，結(jié)果顯示鑒定的總準確率達92.7%，高于VITEK2 Compact鑒定儀和顯色培養(yǎng)法。國外Westblade等[23]利用質(zhì)譜分析技術(shù)對白假絲酵母菌進行鑒定，準確率接近100.0%。王慶玲[24]應用MALDI-TOF MS對假絲酵母菌進行鑒定并與顯色培養(yǎng)以及ATB Expression鑒定結(jié)果比較，在屬、種水平上鑒定一致率均超97.0%。以上說明了質(zhì)譜技術(shù)是一種快速、簡便、準確、高通量的新型白假絲酵母菌檢測鑒定方法，適用于種屬的鑒定、大樣本流行病學研究等方面，只要深入研究并不斷完善數(shù)據(jù)庫資料，質(zhì)譜分析技術(shù)在臨床微生物檢測及鑒定工作中將會得到廣泛的應用。

4 結(jié)語

綜上所述，醫(yī)院由于白假絲酵母菌感染引發(fā)的疾病呈逐年上升趨勢，早期診斷和治療有助于降低患者的死亡率，挽救更多的生命。目前臨床上多采用傳統(tǒng)的方法進行檢測和鑒定，方法簡單實用，具有一定的特異性，但存在敏感性較低、耗時較長的缺點，已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代臨床對檢驗報告早期而精準的要求。分子生物學鑒定技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的真菌檢測的“金標準”，具有較高的靈敏度和特異性，但實驗條件要求較高，在常規(guī)實驗室中的發(fā)展受到限制。質(zhì)譜分析技術(shù)是近期應用于臨床微生物檢驗的鑒定方法，在實驗室的普及率日趨增高，能將真菌準確地鑒定到種的水平，并能矯正傳統(tǒng)鑒定方法的不足與錯誤，是傳統(tǒng)方法的有力補充，有助于耐藥機制的研究，但由于人員技術(shù)、儀器設備和已知數(shù)據(jù)庫較少等問題，目前尚未廣泛投入臨床使用。因此，根據(jù)臨床實驗室的具體情況，以及不同類型標本的檢測意義，選擇適當?shù)蔫b定方法是提高診斷速度及準確度的重點所在。隨著白假絲酵母菌檢測和鑒定技術(shù)的不斷改進、完善及發(fā)展，以及更先進檢測技術(shù)的研發(fā)與應用，將來必定能為臨床白假絲酵母菌病的早期特異診斷和治療提供更寶貴的信息資源。

參 考 文 獻

[1] ?江文俊，姜福全，崔 彥.白色念珠菌生物學特性研究進展[J].基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床，2014，34（4）：550-554.

[2] ?Tan BH，Chakrabarti A，Li RY，et al.Incidence and species distribution of candidemia in Asia：a laboratory-based surveillance study[J].Clin Microbiol Infect，2015，21（10）：946-953.

[3] ?王曉陽，趙作濤，李若瑜.深部念珠菌感染的診斷進展[J].中國真菌學雜志，2008， 3（6）：368-371.

[4] ?Barnes PD，Marr KA.Risks diagnosis and outcomes of invasive fungal infections in haematopoietic stem cell transplant recipients [J].Br J Haematol，2007，139（4）：519-531.

[5] ?石 玉，朱玉霞，樊尚榮，等.分子方法和 API 20C AUX 系統(tǒng)用于鑒定外陰陰道假絲酵母菌病菌種的有效性分析[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2018，27（7）：481-484.

[6] ?朱素梅，魏 峰，劉曉慧，等.念珠菌抗原金標法檢測聚維酮碘輔助治療外陰陰道假絲酵母菌病效果的臨床價值[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2013，34（23）：3160-3161.

[7] ?王端禮.醫(yī)學真菌學實驗室檢驗指南[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：202.

[8] ?李 田，李小毛，丁 杰，等.核酸雜交檢測在細菌性陰道病及外陰陰道假絲酵母菌病診斷中的應用價值[J].實用醫(yī)學雜志，2018，34（10）：1712-1715.

[9] ?Araujo R.Towards the genotyping of fungi：methods，benefits and challenges[J].Curr Fungal Infect Rep，2014，8（3）：203-210.

[10] ?Boriollo MF，Dias RA，F(xiàn)iorini JE，et al.Disparity between multilocus enzyme electrophoresis，microsatellite markers and pulsed-field gel electrophoresis in epidemiological tracking of Candida albicans[J].J Microbiol Methods，2010，82（3）：265-281.

[11] ?Santos PO，Melo JO，Ponzzes CM，et al.Multilocus enzyme electrophoresis analysis and exoenzymatic activity of Candida albicans strains isolated from women with vaginal candidiasis[J].Mycoses，2012，55（1）：64-72.

[12] ?應春妹，張紅菊，唐振華，等.上海3所婦產(chǎn)科醫(yī)院白色念珠菌基因同源性分析[J].中國感染與化療雜志，2015，15（4）：345-348.

[13] ?肖 喻，曹先偉.白假絲酵母菌基因分型方法的研究進展[J].中國感染控制雜志，2017，16（5）：482-486.

[14] ?Vijayakukmar R，Giri S，Kindo AJ，et al.Molecular species identification of Candida from blood samples of intensive care unit patients by polymerase chain reaction-restricted fragment length polymerase [J].J Lab Physicians，2012，4（1）：1-4.

[15] ?Tavanti A，Hensgens LAM，Mogavero S，et al.Genotypic and phenotypic properties of Candida parapsilosis sensu strictu strains isolated from different geographic regions and body sites [J].BMCMicrobiol，2010，48（10）：201-203.

[16] ?Ge YP，Wang L，Lu GX，et al.A simple and reliable PCR-restriction fragment length polymorphism assay to identify Candida albicans and its closely related Candida dubliniensis[J].Braz J Microbiol，2012，43（3）：873-879.

[17] ?Li J，Bai FY.Single-strand conformation polymorphism of microsatellite for rapid strain typing of Candida albicans[J].Med Mycol，2007，45（7）：629-635.

[18] ?張志勤.白假絲酵母菌CA6184全基因組測序及分析[D].南昌：南昌大學，2016.

[19] ?Li D，Li X，Xia R，et al.Molecular surveillance of candidemia due to Candida albicans among cancer patients during 2009 to 2013 by microsatellite typing[J].Microb pathogenesis，2015，81：28-32.

[20] ?Wu K，Luo T，Li L，et al.Multilocus Sequence Typing of Pathogenic Candida albicans Isolates Collected from a Teaching Hospital in Shanghai，China：A Molecular Epidemiology Study[J].PloS one，2015，10（4）：e0125245.

[21] ?王 歡.肝病患者真菌的感染特點和質(zhì)譜快速鑒定研究[D].北京：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院，2015.

[22] ?李艷君，董 蓉，趙強元.MALDI-TOF質(zhì)譜儀進行臨床酵母菌鑒定的方法學評價[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2017，14（17）：2523-2525.

[23] ?Westblade LF，Jennemann R，Branda JA，et al.Multicenter study evaluating the Vitek MS system for identification of medically important yeasts [J].J Clin Microbiol，2013，51（7）：2267-2272.

[24] ?王慶玲.MALDI-TOF MS在真菌鑒定中的應用研究[D].青島：青島大學，2017.