古建雄 劉彬

【摘要】 目的 探討免疫組化與原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測EB病毒用于診斷鼻咽癌的效果。方法 47例鼻咽癌患者作為研究對象， 進行免疫組化和原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測鼻咽癌細(xì)胞中 EB 病毒的表達(dá)情況， 觀察檢測效果。結(jié)果 免疫組化檢測結(jié)果顯示， 廣譜細(xì)胞角蛋白（CK）定位于細(xì)胞漿內(nèi)。原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測結(jié)果顯示， EB病毒編碼的小 RNA（EBER）陽性反應(yīng)定位于鼻咽癌細(xì)胞的細(xì)胞核上。免疫組化檢測后的陽性細(xì)胞的胞膜表現(xiàn)為紅色， 原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測后的陽性細(xì)胞核表現(xiàn)為藍(lán)黑色， 而雙陽性細(xì)胞的核與膜呈現(xiàn)藍(lán)紅色， 不僅對比鮮明同時背景十分清楚， 雙染成功后細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)完整。結(jié)論 免疫組化與原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測EB病毒用于診斷鼻咽癌均有一定作用， 但原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測比免疫組化方法更靈敏， 值得臨床推廣應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 鼻咽癌;病理診斷;原位雜交雙標(biāo)記技術(shù);免疫組化

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.11.012

鼻咽癌是一種在我國南方地區(qū)發(fā)病率非常高的惡性腫瘤， 由于缺乏特異性的診斷方法， 患者往往預(yù)后較差[1]。鼻咽癌又分為角化性鱗狀細(xì)胞癌、非角化性癌以及基底樣鱗狀細(xì)胞癌， 其中未分化型的非角化性癌是最常見的。目前手術(shù)切除以及術(shù)后放化療治療對于提高患者的生存率有很好的作用， 都屬于不可缺少的治療手段[2]。鼻咽癌活檢病理診斷應(yīng)用較多的指標(biāo)是CK免疫組化染色， 可能對鼻咽癌的診斷具有重要意義。免疫組化檢測與原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測， 可同時分析CK與EBER兩種指標(biāo)在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)情況， 免疫組化這種傳統(tǒng)的檢測方法有助于鼻咽癌的病理診斷[3]。本文主要探討免疫組化與原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測EB病毒用于診斷鼻咽癌的效果， 為促進鼻咽癌的診斷提供合理的參考， 現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選擇2004年1月～2018年1月來本院進行治療的47例鼻咽癌患者作為此次研究對象， 其中男27例、女20例。47例鼻咽癌患者均經(jīng)病理學(xué)診斷。組織經(jīng) 4%中性甲醛固定并用常規(guī)石蠟包埋， 切片厚3.5 μm左右。

1. 2 試劑及方法

1. 2. 1 試劑 EGFR基因檢測試劑盒[國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2013第3402095號]， 包括蛋白酶K， FITC標(biāo)記的EBER探針（福建泰普生物科學(xué)有限公司）， 堿性磷酸酶標(biāo)記的抗異硫氰酸熒光素（FITC）抗體（重慶沒濤生物科學(xué)有限公司）， 及BCIP/NBT顯色液等（江西仙巖生物科學(xué)有限公司）;EBER原位雜交試劑盒[國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2012第3400329號]：包括蛋白酶K（福建泰普生物科學(xué)有限公司）， 地高辛標(biāo)記的EBER探針（江西仙巖生物科學(xué)有限公司）， 抗地高辛一抗及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液（福建泰普生物科學(xué)有限公司）等;廣譜CK， 免疫組化超敏SAP染色試劑盒（江西仙巖生物科學(xué)有限公司）， 快紅和3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）顯色劑（江西仙巖生物科學(xué)有限公司）等;進口分裝Dako公司的Envision免疫組化檢測試劑。

1. 2. 2 方法

1. 2. 2. 1 原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測步驟 ①切片常規(guī)脫蠟至水裱貼于經(jīng)防脫處理的潔凈載玻片上;②滴加100 μl蛋白酶K液， 無水酒精脫水后進行干燥處理;③組織上滴加20 μl探針雜交液， 加上蓋玻片;④37℃下孵育3 h取出切片;⑤用含0.1%v/v TritonX-100的Tris緩沖鹽溶液沖洗;⑥室溫孵育10 min， 甩干;⑦加入兔抗FITC/抗核周因子（APF）（ab）室溫孵育30 min;⑧Tris緩沖鹽溶液沖洗5 min;⑨加入BCIP/NBT顯色液4℃孵育過夜， 蘇木精復(fù)染， 脫水、透明、封固。觀察檢測效果。

1. 2. 2. 2 免疫組化具體步驟 ①免疫組化挑選顯色后陽性表達(dá)的切片;②置入pH值為8.0的Tris-EDTA緩沖液中高壓修復(fù)90 s;③磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗， 然后用10%羊血清封閉孵育10 min;④PBS沖洗后滴加廣譜CK一抗100 μl，?稀釋度為1∶200;⑤PBS沖洗后滴加Envision二抗;⑥D(zhuǎn)AB顯色， 顯微鏡下仔細(xì)觀察顯色情況合適時中止顯色;⑦脫水、透明、封固。觀察檢測效果。

2 結(jié)果

免疫組化檢測結(jié)果顯示， 廣譜CK定位于細(xì)胞漿內(nèi)。原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測結(jié)果顯示， EBER陽性反應(yīng)定位于鼻咽癌細(xì)胞的細(xì)胞核上。免疫組化檢測后的陽性細(xì)胞的胞膜表現(xiàn)為紅色， 原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測后的陽性細(xì)胞核表現(xiàn)為藍(lán)黑色， 而雙陽性細(xì)胞的核與膜呈現(xiàn)藍(lán)紅色， 不僅對比鮮明同時背景十分清楚， 雙染成功后細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)完整。

3 討論

鼻咽癌是我國常見癌癥類型之一， 其中鼻咽癌又分為角化性鱗狀細(xì)胞癌、非角化性癌以及基底樣鱗狀細(xì)胞癌。有學(xué)者指出鼻咽癌發(fā)病率為鼻咽部惡性腫瘤之首[4， 5]?，F(xiàn)目前的鼻咽癌的診斷方法缺乏靈敏度與特異性， 但最近又研究發(fā)現(xiàn) EB 病毒感染與鼻咽癌密切相關(guān)， 可能對鼻咽癌的診斷具有重要意義[6]。廣譜CK（AE1/AE3）染色是現(xiàn)目前鼻咽癌診斷中運用得最為廣泛的一個免疫組化指標(biāo)， 因為鼻咽癌細(xì)胞 CK 呈陽性表達(dá)而肉瘤和淋巴瘤細(xì)胞 CK 呈陰性， 所以診斷效果令人滿意， 免疫組化這種傳統(tǒng)的檢測方法有助于鼻咽癌的病理診斷[7]。本次研究表明， 免疫組化檢測結(jié)果顯示， 廣譜CK定位于細(xì)胞漿內(nèi)。原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測結(jié)果顯示， EBER陽性反應(yīng)定位于鼻咽癌細(xì)胞的細(xì)胞核上。免疫組化檢測后的陽性細(xì)胞的胞膜表現(xiàn)為紅色， 原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測后的陽性細(xì)胞核表現(xiàn)為藍(lán)黑色， 而雙陽性細(xì)胞的核與膜呈現(xiàn)藍(lán)紅色， 不僅對比鮮明同時背景十分清楚， 雙染成功后細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)完整。本研究結(jié)果與相關(guān)報道一致[8]。此外， 也有研究表明通過免疫組化檢測來幫助診斷鼻咽癌， 具有操作方便、步驟簡單的優(yōu)勢， 但無法檢出EB病毒的定位及轉(zhuǎn)錄數(shù)量， 因此往往被作為EB病毒的初步篩查方法[9-11]。

綜上所述， 免疫組化與原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測EB病毒用于診斷鼻咽癌均有一定作用， 但原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測比免疫組化方法更靈敏， 值得臨床推廣應(yīng)用。

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[收稿日期：2018-09-20]