雷長國 覃建鋒 梁子聰 王恒 余躍生 蔡林

(1黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558013；2川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科)

程氏蠲痹湯是清代名醫(yī)程鐘齡創(chuàng)制的經(jīng)典方，常用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎一類痹證，臨床療效顯著〔1〕，本研究在許霞等〔2～4〕研究基礎(chǔ)上，進一步探求該方發(fā)揮臨床療效的內(nèi)在機制，為臨床精準(zhǔn)用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康成年SD大鼠，均為雄性，體質(zhì)量(220±15)g，購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(渝)2017-007(SPF級)。提前1 w購入大鼠，動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度(19±2)℃，相對濕度30%～35%，動物房系高清潔級，通風(fēng)良好、自然光照，符合《實驗動物環(huán)境及設(shè)施》要求。

1.2實驗藥品、試劑及儀器 程氏蠲痹湯組方為羌活3 g、獨活3 g、秦艽3 g、桂心1.5 g、當(dāng)歸9 g、川芎2.1 g、桑枝9 g、海風(fēng)藤6 g、木香2.4 g、乳香2.4 g、炙甘草1.5 g，常規(guī)煎煮制備后濃縮，濃度調(diào)整為0.3 g生藥/ml,濾過除菌，-4℃冷藏備用，由黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院中藥房制劑室提供。雷公藤多苷片10 mg×50片(批號：20170302)，由湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司提供。完全弗氏佐劑10 ml/支(批號：201711)，購自貴州鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。大鼠白細胞介素(IL)-17、IL-35酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號分別為201711、201712)，均由南京建成生物工程研究所提供。全自動酶標(biāo)儀(系列號：WH-37104623，邁瑞公司)。電子天平(規(guī)格：KHL-520 g/0.1 g,北京朗科興業(yè)稱重設(shè)備有限公司)。

1.3模型制作 除正常組注射等量生理鹽水外，其余大鼠左后足底常規(guī)消毒后，足跖皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑每只100 μl，并每日數(shù)次對大鼠四肢吹涼風(fēng)、泡冷水，1 w后于大鼠尾根部皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑每只100 μl以加強，繼續(xù)對大鼠四肢吹涼風(fēng)、泡冷水，再1 w后對側(cè)腳關(guān)節(jié)腫脹、功能受限，免疫應(yīng)答形成，建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物模型。

1.4分組處理 除正常組外，其余隨機分為模型組、程氏蠲痹湯高劑量組、低劑量組、雷公藤多苷片組，每組8只，共5組。正常組及模型組均用普通飼料喂養(yǎng)，3個治療組分別在用普通飼料喂養(yǎng)前以相應(yīng)藥物灌服治療，程氏蠲痹湯高劑量組以7.10 g/kg灌服、1次/d,程氏蠲痹湯低劑量組以1.78 g/kg灌服、1次/d，雷公藤多苷片組以6 mg/kg灌服、1次/d，連續(xù)喂養(yǎng)、用藥3 w。

1.5標(biāo)本留取 各組分別于第1、2、3周末灌服藥物后2 h切開股動脈取血5 ml/只，5℃以下靜置6 h,取上清液封裝置于冷凍箱-40℃待測；取血同時留取各組肝、腎、脾、四肢關(guān)節(jié)以4%甲醛液固定待病檢。

1.6指標(biāo)檢測 IL-17和IL-35均采用ELISA雙抗體夾心法，嚴(yán)格按照試劑盒要求測定。將各固定組織進行脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋、切片、貼片、染色、封片，用顯微鏡觀察。

1.7統(tǒng)計方法 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析，均數(shù)多重比較在滿足方差齊性時采用LSD法及Duncan法，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組血清IL-35含量變化 治療第7天，與正常組比較，模型組IL-35含量顯著降低(P<0.01)，3個治療組與模型組比較差異不明顯(P>0.05)；治療第14天，程氏蠲痹湯高劑量組與雷公藤多苷片組差異明顯(P<0.05),程氏蠲痹湯高劑量組與正常組無明顯差異(P>0.05)，雷公藤多苷片組與正常組仍差異明顯(P<0.05)，程氏蠲痹湯低劑量組與模型組無明顯差異(P>0.05)；治療第21天，程氏蠲痹湯高劑量組、雷公藤多苷片組、正常組兩兩比較無明顯差異(P>0.05)，程氏蠲痹湯低劑量組與模型組差異不明顯(P>0.05)。見表1。

2.2各組血清中IL-17含量變化 治療第7天，模型組IL-17含量比正常組明顯增多(P<0.01)，3個治療組與模型組無顯著差異(P>0.05)；治療第14天，程氏蠲痹湯高劑量組、雷公藤多苷片組比模型組明顯降低(P<0.05),程氏蠲痹湯高劑量組與正常組差別不明顯(P>0.05),雷公藤多苷片組比正常組仍明顯偏高(P<0.05)；治療第21天，程氏蠲痹湯高劑量組、雷公藤多苷片組與正常組均無明顯差異(P>0.05)，程氏蠲痹湯低劑量組與模型組無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組治療后各時間點血清IL-35、IL-17含量

與正常組比較：1)P<0.05；與雷公藤多苷片組比較：2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.05

2.3程氏蠲痹湯高劑量組檢測指標(biāo)的相關(guān)性 IL-35、IL-17含量隨治療時間推移呈負相關(guān)(r=-0.756，P=0.019)。

2.4各組踝關(guān)節(jié)病檢結(jié)果 模型組踝關(guān)節(jié)滑膜組織增生、水腫，血管翳形成，滑膜組織內(nèi)小血管增生，擴張充血，大量炎細胞浸潤，以淋巴細胞、單核巨噬細胞和漿細胞，慢性炎細胞浸潤為主，伴大量肉芽腫形成。正常組踝關(guān)節(jié)滑膜組織光滑，滑膜細胞單層排列，無組織水平、增生，無炎癥細胞浸潤。見圖1。程氏蠲痹湯低劑量組滑膜組織增生、水腫，血管翳形成，滑膜組織內(nèi)小血管增生，擴張充血，大量炎細胞浸潤，以淋巴細胞、單核巨噬細胞和漿細胞，慢性炎細胞浸潤為主，伴大量肉芽腫形成；與模型組無明顯差異。程氏蠲痹湯高劑量組滑膜組織增生、水腫情況有所減輕，可見滑膜組織內(nèi)小血管增生，擴張充血，大量炎細胞浸潤，以淋巴細胞、單核巨噬細胞和漿細胞，慢性炎細胞浸潤為主，肉芽腫有所減少；與雷公藤多苷片組治療第7天無明顯差異。治療第14、21天周圍炎癥細胞減少，肉芽腫數(shù)量減少。雷公藤多苷片組治療第7天滑膜組織增生、水腫情況減輕，但仍見滑膜組織內(nèi)小血管增生，擴張充血，大量炎細胞浸潤，以淋巴細胞、單核巨噬細胞和漿細胞，慢性炎細胞浸潤為主，肉芽腫減少；治療第14天滑膜組織內(nèi)小血管增生、擴張充血情況減輕，炎癥細胞減少；治療第21天炎癥細胞減少，肉芽腫數(shù)量減少。見圖2，圖3。5組肝腎病檢無差異，說明用程氏蠲痹湯和雷公藤多苷片在較短時間內(nèi)治療無肝腎毒性，較安全。

圖1 模型組與正常組踝關(guān)節(jié)病理(HE，×100)

治療第7天

治療第14天

治療第21天

治療第7天程氏蠲痹湯低劑量組

治療第4天程氏蠲痹湯低劑量組

治療第21天程氏蠲痹湯低劑量組

治療第7天雷公藤多苷片組

治療第14天雷公藤多苷片組

治療第21天雷公藤多苷片組

3 討 論

IL-17和IL-35是近年發(fā)現(xiàn)的細胞因子家族中的新成員，IL-17是Th17細胞主要效應(yīng)因子，IL-17是T細胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的早期啟動因子，可以通過促進釋放前炎性細胞因子來放大炎癥反應(yīng)，Th17細胞產(chǎn)生的IL-17能有效地介導(dǎo)中性粒細胞動員的興奮過程，從而有效介導(dǎo)組織的炎癥反應(yīng)，IL-17是一種強有力的促炎因子，而IL-35能明顯抑制Th17細胞分化和IL-17合成〔5〕，IL-35能降低IL-17水平，IL-35已成為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療新靶點〔6〕。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠血清中細胞因子IL-35水平明顯減少，而IL-17表達明顯增多，提示在大鼠關(guān)節(jié)炎形成中IL-17是重要的致炎因子〔7～10〕，IL-35的抑炎作用明顯減弱〔11，12〕，本研究以程氏蠲痹湯的配伍比例，適當(dāng)增大劑量，療效是確切的，甚至比常用藥雷公藤多苷片更快達到最佳療效。提示在臨床中，程氏蠲痹湯用藥須持續(xù)至2 w以上并適當(dāng)保持，而雷公藤多苷片用藥須持續(xù)3 w以上并適當(dāng)保持。

本實驗周期較短。臨床中為進一步減輕癥狀、鞏固療效，用藥常會適當(dāng)持續(xù)，為降低機體的藥物耐受性及可能的藥物副作用，可將程氏蠲痹湯、雷公藤多苷片或其他已證明對治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎可靠的藥物交替使用。

程氏蠲痹湯方中的獨活、羌活、秦艽、海風(fēng)藤祛風(fēng)散寒除濕，木香、桂心、桑枝疏通經(jīng)絡(luò)，再佐以乳香、川芎、當(dāng)歸活血化瘀，共用能祛散外邪、疏通筋脈、復(fù)行氣血，自然對風(fēng)寒濕痹證有良效。

本研究對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎用藥的時間節(jié)點和劑量的精準(zhǔn)把握方面作了一定的探求，為中醫(yī)經(jīng)典方劑發(fā)掘利用及內(nèi)在機制闡明提供一定參考。

本研究存在實驗周期短、樣本較少、檢測指標(biāo)較少及模型制作與臨床患者實際致病存在差異等諸多局限，以后的研究中應(yīng)增大樣本數(shù)、模擬臨床的病患周期、考察更多的可能干擾因素，把經(jīng)典方程氏蠲痹湯的臨床及實驗研究引向深入。