成麗英

廣東省連南瑤族自治縣人民醫(yī)院，廣東連南 513300

人類白細(xì)胞抗原B基因（HLA-B）被認(rèn)為是最復(fù)雜的遺產(chǎn)性多態(tài)性系統(tǒng)，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，有關(guān)研究表明引起移植物排斥反應(yīng)的主要抗原為異體HLA，自身HLA可以激發(fā)T細(xì)胞分化發(fā)育、免疫應(yīng)答[1]。HLA-B是屬于hLA- I類抗原中的一類，其編碼基因位于人類第6號(hào)染色體的區(qū)域內(nèi)，通過(guò)糖蛋白的形式，在大多數(shù)有核細(xì)胞的膜表面表達(dá)[2]。HLA在不同民族、不同人種的分布存在差異，我院選取100名廣東瑤族人采用測(cè)序技術(shù)對(duì)人類白細(xì)胞抗原B基因進(jìn)行研究，探究廣東瑤族人群HLA-B基因多態(tài)性研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2017年6月～2018年8月我院4例服用抗癲癇藥物后出現(xiàn)皮膚不良反應(yīng)的瑤族癲癇患者，年齡29～80歲，平均（52.2±2.6）歲；男3例，女1例；所有患者均告知相關(guān)事項(xiàng)并知情同意，留取其抗凝血2mL，進(jìn)行HLA-B*1502基因檢測(cè)。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)儀器 全血人基因組核酸提取純化采用Lab-Aid 824核酸提取儀及其配套的Lab-Aid 824核酸提取Mini試劑盒，兩者均由廈門致善生物科技股份有限公司提供[4]；NanoDrop 2000 超微量紫外分光光度計(jì)由美國(guó)Thermo公司提供；“人類白細(xì)胞抗原 B 位點(diǎn) 1502 基因檢測(cè)試劑盒”由臺(tái)灣世基生物醫(yī)學(xué)股份有限公司提供；CFX-96熒光定量PCR儀由美國(guó)Bio-Rad公司提供。

1.2.2 HLA-B*1502基因檢測(cè) 采用Lab-Aid 824核酸提取儀進(jìn)行全血DNA提取，用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA濃度及純度分析，確保DNA含量＞10ng/μL，OD260/280在1.8～2.0。所提取的DNA如非當(dāng)日使用，置于-20℃保存；使用完畢后剩余的DNA保存于-80℃?zhèn)洳椤?/p>

每一樣本同時(shí)進(jìn)行內(nèi)部質(zhì)控及樣本檢測(cè)兩個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)，其配置如下。內(nèi)部質(zhì)控： PCR混合液12.5μL +內(nèi)部控制基因混合液2.5μL +去核酸純水8μL +待測(cè)DNA2μL；標(biāo)本檢測(cè)：PCR混合液12.5μL +PG1502混合液2.5μL +去核酸純水8μL+待測(cè)DNA2μL。加好的PCR管瞬時(shí)離心后轉(zhuǎn)移至CFX-96熒光定量PCR儀上按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃ 10min預(yù)變性，然后按95℃ 15秒 →71℃ 60秒35循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增；熒光通道設(shè)置為SYBR，熒光信號(hào)收集設(shè)置在71℃ 60秒結(jié)束時(shí)。結(jié)果判讀：內(nèi)部質(zhì)控管CT值≤27，標(biāo)本檢測(cè)管CT值≤35，且標(biāo)本檢測(cè)管CT值-內(nèi)部質(zhì)控管CT值≤7時(shí)，判讀為1502陽(yáng)性；而標(biāo)本檢測(cè)管CT值-內(nèi)部質(zhì)控管CT值＞7時(shí)，或標(biāo)本檢測(cè)管CT值＞35時(shí)，則判讀為1502陰性。

選擇檢測(cè)呈現(xiàn)陽(yáng)性患者采取針對(duì)型護(hù)理的具體方案包括，由我院選取3～4名有豐富臨床經(jīng)驗(yàn)的護(hù)士組成醫(yī)療小組，對(duì)患者的病情狀況進(jìn)行分析，同時(shí)制定優(yōu)質(zhì)的護(hù)理方案。（1）對(duì)于皮疹較重、伴有發(fā)熱等癥狀者應(yīng)臥床休息。關(guān)注患者飲食，避免辛辣刺激性食物。密切關(guān)注患者的生命體征、皮疹變化、數(shù)量、部位等。（2）病室保證清潔，定時(shí)通風(fēng)，對(duì)空氣消毒。叮囑患者保持皮膚清潔，每日用溫水輕擦皮膚，禁用肥皂水、酒精等物質(zhì)。（3）若患者皮膚痛癢，應(yīng)避免搔抓，進(jìn)而造成的皮膚感染。若患者皮膚劇癢，可涂5%碳酸氫鈉或爐甘石洗劑等進(jìn)行緩解。（4）當(dāng)皮膚結(jié)痂后，保證其自行脫落，不要強(qiáng)行撕脫，翹起的痂皮使用消毒剪刀剪去。（5）有系統(tǒng)的組織研究組患者開(kāi)設(shè)有關(guān)疾病的健康知識(shí)講座，講座開(kāi)設(shè)的時(shí)間從在院期間到出院后，對(duì)患者進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的宣教，耐心解決患者的相關(guān)疑問(wèn)[9]。

1.3 觀察指標(biāo)

調(diào)查統(tǒng)計(jì)562例廣東瑤族志愿者的HLA-B等位基因頻率分布。統(tǒng)計(jì)分析廣東瑤族人的HLA-B基因頻率與抗原頻率的分布之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS20.0進(jìn)行分析，其中計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

HLA-B等位基因中基因數(shù)以及抗原數(shù)最多的為B*1401（P＜0.05），其他基因中的基因頻率與抗原頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 HLA-B基因頻率與抗原頻率的分布

3 討論

人類白細(xì)胞抗原（HLA）位于第6染色體短臂上，屬于HLA基因復(fù)合體的編碼產(chǎn)物。HLA為重要抗原物質(zhì)，起到構(gòu)成移植排斥反應(yīng)的作用，其本質(zhì)屬于人類組織復(fù)合體的表達(dá)產(chǎn)物[10]。HLA的研究與器官移植的發(fā)展有直接關(guān)系，因此人類白細(xì)胞抗原又稱移植抗原[11]。

HLA在臨床上的主要作用為器官移植、輸血、疾病的診斷等三個(gè)方面，HLA在器官移植中主要對(duì)臟器或骨髓移植起作用，為成功進(jìn)行移植選擇相對(duì)應(yīng)的的供、受者[14-15]。在腎移植中，供受雙方共有的DR錯(cuò)配抗原數(shù)的多少，決定了移植存活率的高低[16]。在疾病診斷方面HLA可以對(duì)某些與遺傳因素相關(guān)的疾病進(jìn)行篩選，HLA與免疫病理學(xué)具有聯(lián)系，對(duì)T細(xì)胞表面進(jìn)行抗原鑒定。通過(guò)HLA之間的配對(duì)，與相互作用的免疫效應(yīng)細(xì)胞之間構(gòu)成通訊等，擴(kuò)展HLA在生物學(xué)方面的應(yīng)用，如感染、自身免疫、移植物抗腫瘤等的抗原識(shí)別等[17]。本研究中，對(duì)檢測(cè)呈現(xiàn)陽(yáng)性患者采取針對(duì)型護(hù)理，選擇專門的護(hù)理人員，對(duì)其制定專門的護(hù)理方案，研究結(jié)果表明，患者的康復(fù)狀況得到顯著改善。4例患者中，HLA-B*1502基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的有1例，陰性的為3例。采取針對(duì)型的護(hù)理措施后，HLAB*1502基因陽(yáng)性與陰性的患者間，其護(hù)理效果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

對(duì)HLA位點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，臨床上多選擇采用血清學(xué)方法。HLA編碼系統(tǒng)中的B位點(diǎn)是最復(fù)雜，且多態(tài)性最多的部分。B位點(diǎn)的高變區(qū)以及各等位基因的差異主要體現(xiàn)在幾個(gè)堿基的排序之間，且某些等位基因的特別高變區(qū)具有自身獨(dú)特的堿基序列，因而該部位交叉反應(yīng)較多[18]。因血清學(xué)中B位點(diǎn)通常會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)檢、漏檢或定型困難等各類問(wèn)題，本研究的DNA的來(lái)源主要為：從血液中提取出的，此類DNA的特點(diǎn)為含有人類遺傳信息的，化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定。通過(guò)利用序列特異性引物聚合酶的鏈反應(yīng)，對(duì)目的帶進(jìn)行特異性擴(kuò)增，進(jìn)而得到位點(diǎn)分型[19]。本研究采用的PCR SSP方法，被稱為照相分型，該方法具有重復(fù)性良好、準(zhǔn)確性高的優(yōu)勢(shì)。有關(guān)研究表明，采用該方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以DNA為基礎(chǔ)的11428例HLA-B分型的錯(cuò)誤率較低且僅為1.9%。HLA為同種異體抗原，具有高度多態(tài)性，其化學(xué)本質(zhì)為一類糖蛋白，它的組成為一條被糖基化的α重鏈和一條β輕鏈[20]。本研究中，對(duì)比廣東地區(qū)HLA-B基因頻率與抗原頻率的分布，研究結(jié)果表明，HLA-B等位基因中基因數(shù)以及抗原數(shù)最多的為B*1401（P＜0.05），其他基因中的基因頻率與抗原頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。HLA-B *1401的基因分布頻率與抗原頻率分別為0.0106、0.1011，其他基因中的基因頻率與抗原頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。HLA-B*071的抗原頻率與基因頻率最少分別為0.0001、0.0001。

綜上所述，采用測(cè)序技術(shù)對(duì)用藥出現(xiàn)不良反應(yīng)的廣東瑤族人群HLA-B基因進(jìn)行研究，采用針對(duì)型護(hù)理方案，有效地緩解患者的不良反應(yīng)，為遺傳學(xué)以及相關(guān)研究提供資料。