聶志穎， 陳佳璐， 馮 潔， 趙玉玲

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.浙江師范大學(xué) “先進(jìn)催化材料”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 金華 321004)

血紅蛋白(Hb)由含有亞鐵離子和吡咯環(huán)的血紅素組成[1]，在體內(nèi)主要發(fā)揮輸氧儲(chǔ)氧功能，這些功能與血紅素中的亞鐵離子(Fe2+)關(guān)系密切.血紅素依靠范德華力與周圍的疏水性氨基酸殘基保持空間構(gòu)象，金屬離子既可與血紅蛋白殘基上的N，O或S結(jié)合，又可取代血紅素上的Fe2+，引起血紅蛋白結(jié)構(gòu)的改變[2].牛血紅蛋白(BHb)同源于人血紅蛋白，經(jīng)常被作為模型蛋白使用.研究發(fā)現(xiàn)，鉻(VI)酸根離子依靠氫鍵和范德華力使部分血紅素輔基從BHb空腔中脫離[3]，[Hg(SCN)4]2-則通過靜電引力和疏水作用力與血紅蛋白反應(yīng)[4].上述作用均可導(dǎo)致血紅蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，影響血紅蛋白的功能.

過渡金屬鐵、鈷、鎳、銅在元素周期表中居于相鄰位置，是維持生物體正常生理功能所必需的微量元素.Cu2+參與維持鐵的代謝平衡，Ni2+和Co2+參與體內(nèi)血紅蛋白的合成.病理?xiàng)l件下，生物體內(nèi)過渡金屬離子的濃度會(huì)升高，破壞血紅素的結(jié)構(gòu)，影響血紅蛋白的功能.在模擬生理?xiàng)l件下，用紫外可見吸收光譜和熒光光譜研究了Cu2+，Ni2+，Co2+與BHb的相互作用，討論了過渡金屬離子與BHb的熒光猝滅作用，得到了過渡金屬離子與BHb的表觀結(jié)合常數(shù)、作用位點(diǎn)和作用方式，探討了過渡金屬離子對(duì)BHb蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，為研究金屬離子對(duì)血紅蛋白性能的影響提供一定的理論基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

普析TU-1810 PC紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；F7000熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)；ME-T分析天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司)；艾本德移液器(艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司).

牛血紅蛋白(BHb)和三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)購自華美生物工程公司；醋酸銅(Cu(Ac)2)、醋酸鎳(Ni(Ac)2)和醋酸鈷(Co(Ac)2)購自阿拉丁公司；其他試劑均為分析純?cè)噭?，使用前均未作進(jìn)一步處理.

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 溶液準(zhǔn)備

精確配制50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH≈7.0，含100 mmol/L NaCl)；精確稱量BHb，Cu(Ac)2，Ni(Ac)2和Co(Ac)2，加水溶解，在容量瓶中定容，4 ℃避光存放.

1.2.2 過渡金屬離子對(duì)BHb紫外可見圖譜影響

在5 mL比色管中加入相同量的Tris-HCl緩沖溶液和BHb儲(chǔ)備液，依次加入不同濃度Cu2+，Ni2+和Co2+溶液，搖勻，在37 ℃水浴中溫浴30 min，以Tris-HCl為參比液，掃描200～700 nm紫外可見吸收光譜.

1.2.3 過渡金屬離子對(duì)BHb熒光圖譜的影響

在5 mL比色管中，依次加入Tris-HCl緩沖溶液、BHb儲(chǔ)備液和不同濃度Cu2+和Ni2+溶液，以緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻，靜置反應(yīng)5 min.分別測(cè)定280～560 nm范圍內(nèi)，不同溫度(298 K和308 K)的熒光光譜及過渡金屬離子的吸收光譜.測(cè)定中通過固定BHb的濃度從而改變過渡金屬離子的濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 過渡金屬離子與BHb相互作用的紫外可見圖譜分析

2.1.1 過渡金屬離子與BHb相互作用的紫外可見圖譜

280 nm附近的吸收為BHb中芳香族氨基酸共軛鍵導(dǎo)致的紫外吸收，405 nm附近的吸收為血紅素鐵中π～π*躍遷導(dǎo)致的Soret帶吸收.過渡金屬離子在280 nm和405 nm均無吸收.文中主要研究Cu2+，Ni2+和Co2+對(duì)Soret吸收帶的影響，因此僅觀察過渡金屬離子加入后405 nm附近BHb吸收光譜的變化.

由圖1可見，過渡金屬離子可降低BHb在405 nm附近的吸收峰強(qiáng)度，且有輕微藍(lán)移.其原因可能是，Cu2+，Ni2+和Co2+進(jìn)入BHb中血紅素輔基的疏水空腔，通過置換反應(yīng)部分取代Fe2+，形成血紅蛋白衍生物，導(dǎo)致Soret帶吸收強(qiáng)度降低.金屬離子濃度越大，對(duì)BHb中π～π*躍遷的破壞越大.當(dāng)金屬離子與BHb物質(zhì)的量濃度比達(dá)到10∶1時(shí)(此時(shí)金屬離子終濃度為40 μmol/L)，Cu2+，Ni2+和Co2+導(dǎo)致Soret帶吸收的降低值分別為7.9 %，7.3 %和6.9 %，即Cu2+與BHb的相互作用最強(qiáng).

金屬離子的濃度從a到g依次為0，4，8，16，24，32，40 μmol/L

2.1.2 過渡金屬離子與BHb相互作用機(jī)理初探

亞鐵血紅素以Fe2+為中心，形成6配位的正八面體弱場(chǎng).晶體場(chǎng)穩(wěn)定化能(crystal field stabilization energy,CFSE)是影響八面體配合物穩(wěn)定性的主要因素，CFSE的大小與d電子數(shù)的關(guān)系見圖2.Cu2+，Ni2+，Co2+，F(xiàn)e2+的d電子數(shù)分別為d9，d8，d7，d6，由圖2知CFSE的大小依次為CFSE(Fe2+)>CFSE(Cu2+)>CFSE(Co2+)>CFSE(Ni2+).CFSE越小，中心離子所形成的配合物越穩(wěn)定.因此，血紅素金屬配合物的穩(wěn)定順序可能為血紅素鎳>血紅素鈷>血紅素銅>血紅素鐵.也就是說，Cu2+，Ni2+和Co2+均可置換血紅素中的Fe2+，血紅素鎳配合物更穩(wěn)定.

但圖1的紫外可見圖譜顯示血紅素銅配合物更穩(wěn)定.通過歐文-威廉姆斯(Irving-Williams)穩(wěn)定性順序[5-6]和姜-泰勒(John-Teller)效應(yīng)[7-9]對(duì)這一看似矛盾的現(xiàn)象進(jìn)行解釋.依據(jù)歐文-威廉姆斯序列(Mn2+

圖2 八面體弱場(chǎng)中CFSE與d電子數(shù)的關(guān)系

2.2 過渡金屬離子與BHb相互作用的熒光光譜分析

2.2.1 過渡金屬離子與BHb相互作用的熒光光譜

固定激發(fā)波長為280 nm，過渡金屬離子在300～500 nm范圍內(nèi)不發(fā)射熒光，BHb具有330 nm附近的內(nèi)源熒光.固定溫度分別為298 K和308 K時(shí)，發(fā)現(xiàn)過渡金屬離子均導(dǎo)致BHb在330 nm附近的熒光產(chǎn)生有規(guī)律的猝滅，且輕微藍(lán)移.筆者僅展示在308 K時(shí)的熒光光譜(見圖3).

金屬離子的濃度從a到f依次為0，8，16，24，32，40 μmol/L

2.2.2 過渡金屬離子導(dǎo)致BHb熒光猝滅的機(jī)理研究

熒光物質(zhì)分子(熒光體)與不發(fā)熒光的金屬離子或小分子(猝滅體)相互作用，導(dǎo)致熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度降低，稱為熒光猝滅.熒光體與猝滅體發(fā)生碰撞導(dǎo)致動(dòng)態(tài)猝滅，熒光體與猝滅體生成不發(fā)熒光的基態(tài)復(fù)合物導(dǎo)致靜態(tài)猝滅.通常假設(shè)為動(dòng)態(tài)猝滅，則服從動(dòng)態(tài)猝滅方程(Stern-Volmer，斯特恩-沃爾默)[10-11]：

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KD[Q].

其中：F0為BHb的熒光強(qiáng)度；F為加入金屬離子后BHb的熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子猝滅常數(shù)；[Q]為金屬離子的濃度；τ0為生物體的熒光壽命；KD為斯特恩-沃爾默常數(shù).以F0/F為縱坐標(biāo)，[Q]為橫坐標(biāo)，可求出直線斜率KD(見表1).生物體的平均熒光壽命大約為10-8s[12]，據(jù)此求出Kq(見表1).當(dāng)Kq>2.0×1010L·mol-1·s-1時(shí)認(rèn)為是靜態(tài)猝滅[12]，導(dǎo)致熒光體熒光強(qiáng)度降低.由表1可知，Cu2+和Ni2+導(dǎo)致BHb熒光猝滅的Kq大于2.0×1010L·mol-1·s-1，說明金屬離子對(duì)BHb熒光猝滅是形成基態(tài)復(fù)合物所引起的靜態(tài)猝滅.

表1 過渡金屬離子與BHb相互作用的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)(KD)和雙分子猝滅常數(shù)(Kq)

金屬離子T/K斯特恩-沃爾默常數(shù)KD/(L·mol-1)猝滅常數(shù)Kq/(L·mol-1·s-1)Cu2+2984.61×1034.61×10113084.33×1034.33×1011Ni2+2981.93×1031.93×10113083.29×1033.29×1011

2.2.3 過渡金屬離子與BHb結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)

假設(shè)小分子在蛋白質(zhì)上有n個(gè)相同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，按照公式[13-14]：

lg(F0-F)/F=lgKA+nlg[Q].

其中：KA為金屬離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù).以lg(F0-F)/F為縱坐標(biāo)，lg[Q]為橫坐標(biāo)，代入最大熒光發(fā)射峰處(330 nm)的熒光強(qiáng)度，由直線截距和斜率求出結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n及相關(guān)系數(shù)(見表2).

表2 過渡金屬離子與BHb相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)

金屬離子T/K結(jié)合常數(shù)KA/(L·mol-1)結(jié)合位點(diǎn)n相關(guān)系數(shù)Cu2+2981.460×1041.1670.999 73081.070×1041.1400.998 7Ni2+2981.040×1030.9370.998 43080.615×1030.8330.999 8

從表2可知，在所選溫度下，Cu2+和Ni2+均以1∶1的物質(zhì)的量之比與BHb形成靜態(tài)復(fù)合物.在相同溫度下，Cu2+所形成的靜態(tài)復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)最大，也進(jìn)一步證實(shí)了血紅素銅配合物最穩(wěn)定(見圖1).

2.2.4 過渡金屬離子與BHb相互作用時(shí)的距離

金屬離子與BHb中色氨酸殘基相互作用時(shí)的結(jié)合距離可通過福斯特(Forster)共振能量轉(zhuǎn)移理論進(jìn)行計(jì)算[10].能量轉(zhuǎn)移效率E、受體與熒光體結(jié)合距離r以及轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離R0可通過下列公式[11]計(jì)算：

J=[∑F(λ)·ε(λ)·λ4Δλ]/[∑F(λ)·Δλ].

其中：K2(K2=2/3)為取向因子；N(N=1.36)為介質(zhì)的折射指數(shù)；Ф(Φ=0.118)為熒光體的量子產(chǎn)率；J為熒光體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜間的重疊積分；F(λ)為熒光體在波長λ處的熒光強(qiáng)度；Δλ為熒光光譜和吸收光譜中的波長間隔；ε(λ)為受體在波長λ處的摩爾消光系數(shù).測(cè)定溫度為308 K，300～370 nm范圍內(nèi)金屬離子與BHb以1∶1的物質(zhì)的量之比結(jié)合的紫外吸收光譜，與BHb熒光發(fā)射光譜進(jìn)行重疊作圖(見圖4).參照文獻(xiàn)[15-16]，分別求得R0，E和r，數(shù)值列于表3.

a：牛血紅蛋白的熒光發(fā)射光譜；

b：金屬離子的紫外吸收?qǐng)D譜

圖4 Forster非輻射能量轉(zhuǎn)移重疊

血紅素中含有的色氨酸(Trp)殘基分別為α-14 Trp，β-15 Trp和β-37 Trp，血紅蛋白內(nèi)源熒光主要來自β-37 Trp.當(dāng)猝滅體與色氨酸殘基之間的結(jié)合距離r與臨界距離R0滿足R0

從表3可知，不同溫度下Cu2+的結(jié)合距離r(1.96 nm和1.94 nm)和Ni2+的結(jié)合距離r(2.09 nm和1.85 nm)均小于7 nm，但同時(shí)都大于各自的臨界距離R0(1.14 nm和1.11 nm).因此，盡管在金屬離子與BHb的相互作用中發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移(r<7 nm)，但引起B(yǎng)Hb熒光猝滅的主要原因是靜態(tài)猝滅(r>R0)[16].這也與熒光猝滅分析的結(jié)果一致(見表1).

表3 過渡金屬離子與BHb作用的相關(guān)性

金屬離子T/KJ/(cm3·L·mol-1)E/%R0/nmr/nmCu2+2981.389 4×10-160.0131.141.963081.389 4×10-160.0141.141.94Ni2+2989.390 4×10-170.0221.112.093089.381 1×10-170.0441.111.85

2.2.5 過渡金屬離子與BHb之間的相互作用力

小分子和蛋白質(zhì)主要通過靜電作用力、疏水作用力、氫鍵和范德華力等分子間作用力相結(jié)合.根據(jù)反應(yīng)前后的熱力學(xué)函數(shù)變(焓變?chǔ)和熵變?chǔ))，可以判斷小分子與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型.通常，ΔH>0，ΔS>0，為疏水作用力；ΔH<0，ΔS>0，為靜電作用力；ΔH<0，ΔS<0，為氫鍵和范德華力[17].當(dāng)不發(fā)生熱力學(xué)相變時(shí)，在一定溫度范圍內(nèi)ΔH基本不變.由以下熱力學(xué)公式[17]：

ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R;

ΔG=-RTlnK;

ΔG=ΔH-TΔS.

結(jié)合金屬離子與BHb在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)KA(見表2)，計(jì)算金屬離子與BHb相互作用的熱力學(xué)函數(shù)(見表4).由表4可知，過渡金屬離子主要以靜電作用力與BHb形成不發(fā)熒光的基態(tài)復(fù)合物，導(dǎo)致BHb產(chǎn)生熒光猝滅.

表4 過渡金屬離子與BHb之間的相互作用力

金屬離子ΔH/(KJ·mol-1)ΔS/(J·mol-1·K-1)Cu2+-23.720.13Ni2+-40.0976.78

2.2.6 過渡金屬離子對(duì)BHb構(gòu)象的影響

固定波長的同步熒光光譜常用于判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變.固定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，分別掃描308 K時(shí)BHb中酪氨酸殘基和色氨酸殘基的同步熒光光譜[11].由圖5和圖6可知，BHb的熒光主要由色氨酸殘基貢獻(xiàn).過渡金屬離子基本不改變酪氨酸殘基的發(fā)射波長和峰形(見圖5)，但可以使色氨酸殘基的發(fā)射波長輕微藍(lán)移(見圖6).結(jié)果表明，過渡金屬離子的加入可增強(qiáng)色氨酸所處環(huán)境的疏水性，改變BHb的構(gòu)象[18].

Cu2+和Ni2+的濃度從a到f依次為0，8，16，24，32，40 μmol/L

Cu2+和Ni2+的濃度從a到f依次為0，8，16，24，32，40 μmol/L

3 結(jié) 論

血紅素疏水腔中的亞鐵離子可以被過渡金屬離子部分置換，形成血紅蛋白衍生物，衍生物的穩(wěn)定性與過渡金屬離子中d電子的數(shù)目相關(guān).過渡金屬離子通過靜電作用力與BHb形成穩(wěn)定不發(fā)熒光的基態(tài)復(fù)合物，以靜態(tài)猝滅的方式降低BHb的熒光強(qiáng)度.金屬離子的加入使BHb中色氨酸殘基所處疏水性增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生改變.