茍美玲，張靜

(成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，成都 611130)

郫縣豆瓣醬被譽(yù)為“川菜之魂”，以二荊條紅辣椒、青皮蠶豆等為主要材料，通過自然發(fā)酵而成[1]。目前標(biāo)準(zhǔn)中雖然對郫縣豆瓣的理化指標(biāo)提出了規(guī)范要求，但對郫縣豆瓣醬中的亞精胺含量未做相關(guān)規(guī)定。郫縣豆瓣醬中的亞精胺主要來源于原料蠶豆和發(fā)酵微生物的脫羧反應(yīng)[2]。亞精胺具有抗氧化、抗炎、改善線粒體代謝的功能[3]。近年來，亞精胺的抗衰老活性越來越受到人們的關(guān)注[4]。亞精胺的許多抗衰老作用與受損細(xì)胞器的降解和自噬機(jī)制的激活使細(xì)胞質(zhì)材料的回收有關(guān)[5,6]。亞精胺也存在于人體內(nèi)，與人類健康息息相關(guān)[7]。適量的亞精胺有益于人體健康，但當(dāng)其在動物和人體內(nèi)積聚達(dá)到高水平或其攝入過量時會變得具有毒性[8]，可能引起頭痛、頭暈、惡心、心悸等癥狀[9,10]，因此有必要對郫縣豆瓣中亞精胺的含量進(jìn)行有效檢測和控制。

由于亞精胺結(jié)構(gòu)中沒有生色基團(tuán)，既沒有紫外吸收，也沒有熒光及電化學(xué)活性，使得亞精胺的分離和測定都存在一定的困難，目前文獻(xiàn)報道的測定亞精胺的方法主要有氣相色譜法(GC)[11]、高效液相色譜法(HPLC)[12]、離子色譜法(IC)[13]、薄層色譜法(TLC)[14]、生物傳感器法[15]、毛細(xì)管電泳法(CE)[16]等。

由于高效液相色譜法具有分離效率高、分析速度快、柱效高、檢測靈敏度高、定量分析準(zhǔn)確等特點，國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.208-2008和許多文獻(xiàn)中均使用高效液相色譜法測定食品中的亞精胺含量。但是高效液相色譜法需要將目標(biāo)物進(jìn)行柱前或柱后衍生之后才能進(jìn)行檢測，因此存在衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定、操作復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻、質(zhì)量控制相對較難等不足，顯然不適合作為郫縣豆瓣醬的大量檢測。因此，本文旨在建立一種簡單、快速的亞精胺檢測方法，適用于大批量郫縣豆瓣醬中亞精胺的監(jiān)控。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用10種豆瓣醬均購于成都某超市，命名為YP-1～YP-10。

亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；乙腈(色譜級)：美國Sigma公司；甲酸(色譜級)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

X500R飛行時間質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源，ESI) 美國AB SCIEX公司；超高效液相色譜系統(tǒng) 日本SHIAMDZU公司；Heto-HSC500真空冷凍干燥機(jī) 上海佰蕾真生物科技有限公司；SB-5200 DNT超聲清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；萬能高速粉碎機(jī) 深圳尼嘉商貿(mào)有限公司；TD-5M離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；IKA Vortex 2渦旋混勻器 德國IKA公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

分別稱取50 g樣品于-50 ℃真空冷凍干燥機(jī)中24 h，干燥后用萬能高速粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，然后盛裝在潔凈的密封袋中，備用。

稱取0.5 g樣品粉末于50 mL離心管中，加入20 mL色譜級乙腈，渦旋30 s，于20 ℃超聲提取30 min，4000 r/min離心15 min，取上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取1 mg(精確至0.00001 g)亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品，加入10 mL乙腈溶液，配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 超高效液相色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；柱溫：30 ℃，流速：0.2 mL/min，進(jìn)樣量：2 μL；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液；洗脫梯度：0～3 min，20%～50% A；3～5 min，50%～100% A；5～7 min，100% A；7～10 min，100%～20% A；柱溫：30 ℃，流速：0.2 mL/min，進(jìn)樣量：2 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(electron spray ionization，ESI)，正離子模式；噴霧氣1(gas 1)：45 psi，噴霧氣2(gas 2)：50 psi；氣簾氣(CUR)：35 psi；溫度：500 ℃；離子化電壓：5500 V；去簇電壓(declustering potential，DP)：60 V；碰撞能量(collision energy，CE)：20 V。全掃使用Q-TOF的IDA，一級質(zhì)量掃描范圍m/z 50～250。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確定

2.1.1 母離子選擇

以20 mg/L的亞精胺標(biāo)準(zhǔn)溶液為實驗對象，在正離子掃描模式下進(jìn)行母離子全掃描，掃描范圍m/z 50～250，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，響應(yīng)強(qiáng)度最高的為m/z 146.1644 離子，響應(yīng)強(qiáng)度高達(dá)1.5×106cps，由亞精胺分子式C7H19N3可知該離子為亞精胺的加氫離子，因此選擇m/z146.1644離子為母離子。

2.1.2 子離子選擇

以加氫離子m/z 146.1644為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，亞精胺的二級質(zhì)譜圖見圖2，其主要產(chǎn)生5個碎片離子，分別為m/z 129.1386，112.1120，84.0808，72.0806，58.0651。

由圖2可知，碎片離子m/z 72.0806是響應(yīng)值最高的子離子，因此選擇m/z 146.1649/72.0806為定量離子對，其次為m/z 112.1120，因此選擇m/z 146.1649/112.1120為定性離子對。

2.1.3 MRM優(yōu)化結(jié)果

由圖2可知，m/z 146.1649/72.0806為定量離子對，m/z 146.1649/112.1120為定性離子對。因此以子離子m/z 72.0806和m/z 112.1120的響應(yīng)強(qiáng)度為評價指標(biāo)，對亞精胺的去簇電壓及碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖3。

圖1 亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液母離子掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Scanning mass spectrometry of precursor ion in spermidine standard solution

圖2 亞精胺標(biāo)準(zhǔn)溶液二級質(zhì)譜圖Fig.2 Scanning mass spectrometry of fragment ions in spermidine standard solution

圖3 MRM條件優(yōu)化：去簇電壓(A)和碰撞能量(B)Fig.3 MRM condition optimization: declustering potential (A) and collision energy (B)

由圖3A可知，碎片離子m/z 72.0806和m/z 112.1120在去簇電壓為65 V時達(dá)到最大響應(yīng)值。當(dāng)去簇電壓超過65 V時，二者的響應(yīng)值均有不同程度的下降，因此選擇65 V為最佳的去簇電壓。由圖3B可知，碎片離子m/z 72.0806和m/z 112.1120的響應(yīng)強(qiáng)度隨碰撞能量的增加而增加，當(dāng)碰撞能量達(dá)到25 V時獲得了最大響應(yīng)值，因此選擇25 V為最佳碰撞能量。

2.2 方法學(xué)研究

在本研究中，通過測定加標(biāo)回收率、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限、定量限、精密度來驗證方法的準(zhǔn)確性。

2.2.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限

將亞精胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈稀釋成5個濃度：10.0，4.0，2.0，1.0，0.5 mg/L。按優(yōu)化好的實驗條件進(jìn)行分析，以亞精胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(x)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)R2。檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別以標(biāo)準(zhǔn)溶液3∶1和10∶1進(jìn)行計算，結(jié)果見表1。

表1 方法的線性參數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限及定量限Table 1 Linear parameters, matrix effect, detection limits and quantification limits of the method

由表1可知，亞精胺在0.5～10 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2>0.999，檢出限為0.031 mg/kg，定量限為0.121 mg/kg。

2.2.2 基質(zhì)效應(yīng)

在使用UPLC-MS/MS測定樣品中亞精胺含量時，由于基質(zhì)中不易揮發(fā)的共洗脫成分在噴霧液滴轉(zhuǎn)移到氣態(tài)離子的過程中會與目標(biāo)分析物產(chǎn)生競爭關(guān)系，使得目標(biāo)分析物的質(zhì)譜信號增強(qiáng)或者減弱，從而影響實驗方法的精密度、準(zhǔn)確度[17,18]。盡管串聯(lián)質(zhì)譜法具有高靈敏度和高選擇性，也依然不能從根本上消除基質(zhì)效應(yīng)[19]，因此對基質(zhì)效應(yīng)的研究具有重要意義。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液是用樣品提取液溶解標(biāo)準(zhǔn)品，然后用樣品溶液對其進(jìn)行連續(xù)稀釋。本研究隨機(jī)采用YP-1和YP-2作為基質(zhì)效應(yīng)測定的2種基質(zhì)，分別用YP-1和YP-2溶解稀釋亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品，最終亞精胺濃度范圍為0.55～6.25 mg/mL。

由表1可知，亞精胺在YP-1和YP-2的基質(zhì)效應(yīng)分別為-17.72%和-17.42%，2個樣品的基質(zhì)效應(yīng)較為接近，其絕對值均小于20%，因此可以認(rèn)為其幾乎沒有基質(zhì)效應(yīng)?？梢哉J(rèn)為，郫縣豆瓣醬中的基質(zhì)對亞精胺含量檢測的影響不顯著，因此可以直接采用標(biāo)準(zhǔn)曲線對亞精胺進(jìn)行定量分析。

2.2.3 精密度與回收率

在上述優(yōu)化好的條件下，在樣品中添加高、中、低單個濃度的亞精胺，每個濃度平行測定6次，測定其加標(biāo)回收率和精密度。精密度用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。本實驗選擇YP-1和YP-2測定其加標(biāo)回收率和精密度，結(jié)果見表2。

表2 方法的加標(biāo)回收率和精密度測定結(jié)果(n=6)Table 2 The detection results of recovery rates and precision of the method (n=6)

由表2可知，亞精胺的平均回收率在92.65%～100.58%范圍內(nèi)，RSD在2.01%～6.98%范圍內(nèi)，表明此UHPLC-Q-TOF方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性較好，可用于快速檢測樣品中亞精胺的含量。

2.3 樣品的測定

由于紅油豆瓣醬中具有較為完整的蠶豆瓣子以及較大塊的辣椒皮，因此首先對樣品進(jìn)行勻漿均質(zhì)處理，使其呈現(xiàn)較為均勻的醬體形態(tài)。采用上述建立的UHPLC-Q-TOF方法對10種市售品牌紅油豆瓣醬中的亞精胺含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 10種郫縣紅油豆瓣醬樣品中亞精胺的含量Table 3 The content of spermidine of 10 kinds of Pixian bean paste mg/kg

續(xù) 表

注：同列肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

由表3可知，亞精胺含量范圍為12.1～29.2 mg/kg，不同品牌紅油豆瓣醬中的亞精胺含量均有顯著性差異(p<0.05)，亞精胺含量最高的樣品(YP-2)是含量最低的樣品(YP-6)的2.4倍。豆瓣醬中亞精胺含量主要來源于原料蠶豆和發(fā)酵微生物的作用，各品牌廠家的原料來源、配比和制作工藝等因素都會影響亞精胺的含量，因此今后有必要對郫縣豆瓣醬中的亞精胺含量建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本實驗建立了利用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)快速測定郫縣豆瓣醬中亞精胺含量的方法。實驗以乙腈為提取溶劑，在正離子掃描模式下，采用65 V為最佳的去簇電壓，25 V為最佳的碰撞能量對10種市售品牌郫縣紅油豆瓣醬中的亞精胺含量進(jìn)行了測定，并對方法進(jìn)行了系統(tǒng)校驗。實驗結(jié)果表明，亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品在設(shè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好(R2>0.999)，加標(biāo)回收率在92.65%～100.58%之間，實驗重復(fù)性和儀器精密度較好。

綜上所述，本實驗建立的UHPLC-Q-TOF方法簡單可行，可在短時間內(nèi)對郫縣豆瓣醬中的亞精胺進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析。