熊亞，李敏杰*

(1.攀枝花學院 生物與化學工程學院，四川 攀枝花 617000；2.攀枝花市 干熱河谷特色生物資源工程技術中心，四川 攀枝花 617000)

與糧食醋相比，果醋的營養(yǎng)成分更為豐富，且口味醇厚、風味濃郁、新鮮爽口、功效獨特。果醋因其良好的飲用風味與營養(yǎng)保健功能，已受到越來越多消費者的歡迎，人們對果醋的營養(yǎng)、口感、風味的要求日益俱增[1-3]。目前雖然果醋的品種開始增多，也不斷有各種復合醋研制的報道[4-6]，但果醋市場的品種及口味還比較單一，復合型醋飲料及調味品仍具有很大的市場潛力。

紅心火龍果和柚子都是很好的食用資源，火龍果除了是一種高纖維、低脂肪、低糖度的水果外，還含有碳水化合物、粗纖維、不飽和脂肪酸、抗氧化物、VC和花青素等，甚至還含有其他植物少有的植物性蛋白，對人體重金屬中毒具有解毒的功效[7]。柚子含多種糖類、有機酸、維生素和各種無機鹽，對人體十分有益[8]，柚子果肉及皮含有生物活性物質生物苷[9]，可以降低血液粘稠度，對腦血管疾病如腦血栓、腦卒等有較好的預防作用[10]。目前對它們的利用主要集中在果汁飲料、果酒、單一果醋的發(fā)酵方面[11-16]，對紅心火龍果柚子復合醋的研制尚未見相關報道。本試驗采用響應面法，對紅心火龍果柚子復合醋的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，以期為開發(fā)復合醋市場潛力、綜合資源利用等提供一定的理論和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

坪山柚、紅心火龍果：購于沃爾瑪超市；酵母(安琪高活性酵母)：湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；果醋菌：煙臺帝伯仕自釀有限公司；果膠酶(3×105U/g)：江蘇銳陽生物科技有限公司；亞硫酸(99.8%)、檸檬酸(AR)、NaOH(AR)：成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

THZ-C恒溫搖床培養(yǎng)箱 江蘇省金壇市大地自動化儀器廠；FA2204B型電子天平 上海越平科學儀器有限公司；Q/GHSC型精密pH計 上海森信試驗儀器有限公司；WYT-J型手持式糖度儀 成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司；D2KW-4型電熱恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；0-40型酒精計 國營河北省武強縣儀表廠；T2264MD榨汁機 上海九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

紅心火龍果、柚子→洗凈、去皮、榨汁→以一定比例混合→酶解→過濾→SO2、果膠酶↓濾汁→成分調整↑酵母、白砂糖、檸檬酸→酒精發(fā)酵→酒精發(fā)酵液→加入醋酸菌→醋酸發(fā)酵→殺菌→成品。

1.3.2 操作要點

原料預處理：將紅心火龍果和柚子洗干凈，去掉果皮，柚子去核，然后將去皮紅心火龍果和柚子分別切成大小合適的小塊，放入榨汁機破碎榨汁。

SO2、果膠酶的添加：榨汁后加入60 mg/L的二氧化硫以防止雜菌污染，并加入50 mg/L果膠酶酶解1 h以分解果膠，增加出汁率。

成分調整：加入白砂糖調節(jié)初始糖度為220 g/L，加入檸檬酸調節(jié)酸度為4.5 g/L，加入酵母菌進行酒精發(fā)酵。

酒精發(fā)酵：按照試驗方案調整好后，放置于恒溫培養(yǎng)箱(溫度按照試驗方案進行調整)中發(fā)酵8 d。

醋酸發(fā)酵：按照試驗方案將酒精發(fā)酵液放置于恒溫搖床(溫度按照試驗方案進行調整)中進行醋酸發(fā)酵，發(fā)酵10 d。

1.3.3 酒精發(fā)酵單因素試驗和正交試驗

試驗選取溫度(22，24，26，28，30 ℃)、酵母菌接種量(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/L)、紅心火龍果汁與柚子汁的體積混合比例(1∶1、2∶3、3∶7、1∶4、1∶9)進行單因素試驗，測定紅心火龍果柚子酒的酒精度。根據(jù)單因素試驗結果，設計三因素三水平的正交試驗。以最終產品的酒精度為指標，得出紅心火龍果柚子酒的最佳發(fā)酵參數(shù)。根據(jù)正交試驗結果，利用正交助手V3.1軟件進行方差分析。

1.3.4 醋酸發(fā)酵單因素和響應面試驗

紅心火龍果柚子復合果醋的發(fā)酵是在生成紅心火龍果柚子復合果酒的基礎上，在有氧的條件下，利用果醋菌，將果酒轉化為果醋的過程。醋酸含量作為衡量產品質量的標準。由大量資料查得，影響果醋發(fā)酵最大的因素分別為發(fā)酵溫度、初始酒精度和醋酸菌接種量。因此，選取發(fā)酵溫度(28，30，32，34，36 ℃)、果醋菌接種量(300，400，500，600，700 mg/L)、初始酒精度(4%、6%、8%、10%、12%)來進行單因素試驗。在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Benhnken設計原理，以初始酒精度(X1)、發(fā)酵溫度(X2)、醋酸菌接種量(X3)為自變量，以醋酸含量(Y)為響應值，設計三因素三水平的響應面試驗，優(yōu)化發(fā)酵工藝。

1.3.5 理化指標的測定

酒精度的測定：采用蒸餾法對果酒的酒精度進行測定；醋酸含量的測定：利用強堿滴定弱酸的中和滴定原理來進行醋酸含量的測定。

2 結果與分析

2.1 酒精發(fā)酵單因素和正交試驗

2.1.1 不同發(fā)酵溫度對酒精度的影響

圖1 溫度對紅心火龍果柚子汁酒精度的影響Fig.1 The effect of temperature on alcohol degree of red pitaya and pomelo juice

由圖1可知，當溫度低于26 ℃時，隨著溫度升高，酒精度升高；當溫度高于26 ℃時，隨著溫度升高，酒精度降低；當溫度為26 ℃時，酒精度最高，為4.2%。這可能是由于溫度影響了酵母菌的活性，溫度較低時，酵母菌的生長受到抑制；溫度較高時，酵母菌容易死亡。因此，選定紅心火龍果柚子汁酒精發(fā)酵的最佳溫度為26 ℃。

2.1.2 酵母菌接種量對酒精度的影響

由圖2可知，當酵母菌接種量低于0.4 g/L時，隨著酵母菌接種量升高，酒精度升高；當酵母菌接種量高于0.4 g/L時，隨著酵母菌接種量升高，酒精度降低；當酵母菌接種量為0.4 g/L時，酒精度最高，為4.2%。這可能是由于發(fā)酵液的營養(yǎng)成分影響了酵母菌的活性，酵母菌接種量較低時，營養(yǎng)成分過剩，酵母菌不能產生更多酒精；酵母菌接種量較高時，營養(yǎng)成分有限，反而抑制了酵母菌產生酒精。因此，選定紅心火龍果柚子汁酒精發(fā)酵的最佳酵母菌接種量為0.4 g/L。

圖2 酵母菌接種量對酒精度的影響Fig.2 The effect of inoculation amount of yeast on alcohol degree

2.1.3 紅心火龍果汁柚子汁混合比例對酒精度的影響

圖3 紅心火龍果汁和柚子汁混合比例對酒精度的影響Fig.3 The effect of the proportion of red pitaya juice and pomelo juice on alcohol degree

由圖3可知，當2種水果果汁比例低于1∶4時，隨著柚子汁比例升高，酒精度升高；當果汁比例高于1∶4時，隨著柚子汁比例升高，酒精度降低；當果汁比例為1∶4時，酒精度最高，為4.2%。這可能是由于發(fā)酵液的糖含量影響了酵母菌的活性，紅心火龍果的甜度要高于柚子，如果紅心火龍果汁比例過高，糖含量較高時，過高的糖含量反而抑制了酵母菌產生酒精；糖含量較低時，也不利于酵母菌發(fā)酵，不能產生更多酒精；因此根據(jù)酒精度，選定紅心火龍果汁和柚子汁的最佳體積比例為1∶4。

2.1.4 紅心火龍果柚子復合醋酒精發(fā)酵正交試驗

表1 紅心火龍果柚子復合醋酒精發(fā)酵正交試驗設計Table 1 The design of orthogonal experiment for alcoholic fermentation of red pitaya and pomelo compound vinegar

表2 紅心火龍果柚子復合醋酒精發(fā)酵正交試驗結果Table 2 Orthogonal experimental results of alcoholic fermentation of red pitaya and pomelo compound vinegar

表3 紅心火龍果柚子復合醋酒精發(fā)酵 正交試驗結果方差分析Table 3 The variance analysis of orthogonal experimental results of alcoholic fermentation of red pitaya and pomelo compound vinegar

由表2可知RC>RA>RB，即紅心火龍果汁與柚子汁的混合比例對紅心火龍果柚子復合醋的酒精度影響最大，其次是溫度，酵母菌接種量的影響最小，最優(yōu)組合是A2B2C1，即溫度為26 ℃，酵母菌接種量為0.4 g/L，紅心火龍果汁與柚子汁的混合比例為3∶7。由表3可知，各因素的F比都小于F臨界值，各因素的影響均不顯著。

2.2 醋酸發(fā)酵單因素和響應面試驗

2.2.1 發(fā)酵溫度對醋酸含量的影響

由圖4可知，在初始酒精度為8%、果醋菌接種量為500 mg/L、搖床培養(yǎng)1周后，當發(fā)酵溫度在34 ℃以下時，醋酸含量隨著發(fā)酵溫度的升高而逐漸上升，從32 ℃開始，上升幅度明顯增大。發(fā)酵溫度為34 ℃時醋酸含量達到最高，為0.278 mol/L，溫度超過34 ℃以后，醋酸含量隨發(fā)酵溫度的升高不斷降低。溫度對醋酸菌的生長影響較大，溫度過低，醋酸菌生長緩慢，發(fā)酵周期延長，所以較低溫度范圍內，醋酸生成較為緩慢。但溫度過高反而會抑制微生物細胞內某些酶的作用甚至使其喪失活性，加快了菌體老化，使發(fā)酵產酸降低。因此，選取34 ℃為紅心火龍果柚子復合醋發(fā)酵的最佳溫度。

圖4 發(fā)酵溫度對醋酸含量的影響Fig.4 The effect of fermentation temperature on acetic acid content

2.2.2 果醋菌接種量對醋酸含量的影響

圖5 果醋菌接種量對醋酸含量的影響Fig.5 The effect of inoculation amount of acetic acid bacteria on acetic acid content

由圖5可知，在發(fā)酵溫度為34 ℃、初始酒精度為8%、搖床培養(yǎng)1周后，醋酸含量隨果醋菌接種量的增加而增加，在果醋菌接種量為600 mg/L時達到最高，為0.341 mol/L，之后則隨著接種量的增加而下降。接種量在一定范圍內，較高的接種量有利于提高醋酸的產量，但如果接種量過大，由于醋酸菌的生長本身也會消耗掉發(fā)酵液中大量的營養(yǎng)物質，造成營養(yǎng)物質缺乏，醋酸形成不足。因此，選取600 mg/L為果醋菌的最佳接種量。

2.2.3 初始酒精度對醋酸含量的影響

由圖6可知，在發(fā)酵溫度為34 ℃、醋酸菌接種量為600 mg/L、搖床培養(yǎng)1周后，初始酒精度在10%以下時，醋酸含量隨著初始酒精度的升高不斷上升，初始酒精度為10%時達到最高，為0.146 mol/L。當初始酒精度大于10%之后，醋酸含量開始下降。酒精是醋酸菌進行繁殖代謝的主要營養(yǎng)物質，在醋酸發(fā)酵過程中，醋酸菌利用乙醇將其氧化成為醋酸和水。在一定范圍內，提高發(fā)酵液中的初始酒精度，可以提高醋酸發(fā)酵過程的產酸量，但是過高的酒精濃度也會對醋酸菌的生長和代謝產生抑制作用。因此，選取初始酒精度10%為紅心火龍果柚子復合果醋發(fā)酵的最佳條件。

圖6 初始酒精度對醋酸含量的影響Fig.6 The effect of initial alcohol degree on acetic acid content

2.2.4 紅心火龍果柚子復合醋醋酸發(fā)酵響應面試驗

根據(jù)單因素試驗結果，進行三因素三水平的響應面試驗設計，結果見表4和表5。

表4 響應面分析因素及水平Table 4 The factors and levels of RSA

表5 響應面試驗方案及試驗結果Table 5 The scheme and results of RSA

表6 回歸分析結果Table 6 The results of regression analysis

續(xù) 表

注：“*”表示差異顯著(P<0.05)；“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

由表6可知，模型的P<0.0001<0.01，表明模型方程極顯著，說明試驗方法可行可靠；失擬項P=0.1745>0.05，失擬項不顯著，說明回歸方程的擬合度較好，能很好地反映工藝中各種因素和酸度(Y)之間的準確關系，能夠利用回歸方程式得出最優(yōu)的工藝條件；模型的回歸決定系數(shù)R2=0.9751，表明有97.51%的響應值變化是因為所選擇的因素。X2對Y有顯著影響，是正效應且極顯著；交互項X1X2、X2X3對Y有顯著影響，都為負效應，X1X2影響極顯著；二次項X12、X22、X32也對Y有顯著影響，都為負效應且影響極顯著，其余的變量影響都不顯著(P>0.05)。

經回歸擬合后，得到回歸方程：

Y=1.2-0.049X1+0.2X2-0.039X3-0.19X1X2-0.043X1X3-0.09X2X3-0.26X12-0.32X22-0.17X32。

對X1、X2、X3做如下變化：X1=(A-10)/2；X2=(B-34)/2；X3=(C-600)/100。

對回歸方程的各個因素求二階方程并計算，結果如下：X1=-1.38；X2=0.74；X3=-0.136。

把X1、X2、X3帶入到變換的式子中，得到A，B，C分別等于7.24、35.48、586.4。即紅心火龍果柚子復合果醋發(fā)酵工藝的最適初始酒精度、發(fā)酵溫度、果醋菌接種量分別為7.24%、35.48 ℃、586.4 mg/L。響應值Y(酸度)為0.94 mol/L。

2.2.5 紅心火龍果柚子復合果醋的工藝條件優(yōu)化響應面圖及等高線圖

響應面分析及等高線圖見圖7～圖9(圖7～圖9中的A，B，C分別代表X1、X2、X3)。

圖7 Y=f(X1，X2)的響應面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour of Y=f(X1,X2)

注：Y表示響應值酸度(mol/L)，X1表示初始酒精度(%)，X2表示發(fā)酵溫度(℃)。

圖8 Y=f(X1，X3)的響應面及等高線圖Fig.8 Response surface and contour of Y=f(X1,X3)

注：Y表示響應值酸度(mol/L)，X1表示初始酒精度(%)，X3表示果醋菌接種量(mg/L)。

圖9 Y=f(X2，X3)的響應面及等高線圖Fig.9 Response surface and contour of Y=f(X2,X3)

注：Y表示響應值酸度(mol/L)，X2表示發(fā)酵溫度(℃)，X3表示果醋菌接種量(mg/L)。

圖7顯示響應面的坡度較陡，酸度受發(fā)酵溫度和初始酒精度的影響較大；酸度隨著發(fā)酵溫度和初始酒精度的增加，呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。從等高線密度來看，發(fā)酵溫度軸向等高線密度相對較大，表明發(fā)酵溫度對醋酸含量的影響比初始酒精度大。此外，等高線圖中的橢圓度較大，表明發(fā)酵溫度和初始酒精度兩因素的交互作用較強，對酸度的影響顯著。圖8顯示響應面的坡度較陡，表明酸度受接種量和初始酒精度的影響較大；酸度隨著接種量和初始酒精度的增加，呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。等高線圖表明兩因素軸向等高線密度相差不大，即初始酒精度和接種量對酸度的影響大致相同。圖9顯示響應面的坡度較陡，酸度受接種量和發(fā)酵溫度的影響較大；酸度隨接種量和發(fā)酵溫度的增加，呈先增加后減小的趨勢。從等高線密度可以看出，發(fā)酵溫度軸向等高線密度相對較大，表明發(fā)酵溫度對酸度的影響比接種量的影響大，發(fā)酵溫度和接種量兩因素的交互作用較強，對酸度的影響顯著。

2.2.6 驗證試驗

為驗證響應面法所得結果的正確性，根據(jù)實際情況對通過響應面試驗獲得的最佳發(fā)酵工藝條件進行修正，修正為初始酒精度7%、發(fā)酵溫度35 ℃、果醋菌接種量586 mg/L，在此發(fā)酵工藝條件下重復紅心火龍果柚子復合果醋發(fā)酵3次，測得平均酸度為0.98 mol/L，與預測值0.94 mol/L相對誤差只有0.04%，可見模型能很好地預測紅心火龍果柚子復合果醋發(fā)酵的實際情況，即基于響應面法優(yōu)化的紅心火龍果柚子復合果醋的發(fā)酵參數(shù)是比較可靠的。

3 結論

利用單因素試驗和響應面法獲得紅心火龍果柚子復合果醋的最佳工藝條件為初始酒精度7.24%、發(fā)酵溫度35.48 ℃、果醋菌接種量572.4 mg/L，由回歸方程可得出在此條件下紅心火龍果柚子復合果醋發(fā)酵的酸度理論值為0.94 mol/L。根據(jù)實際情況修正各因素值得到最優(yōu)的因素條件為初始酒精度7%、發(fā)酵溫度35 ℃、醋酸菌接種量586 mg/L，通過驗證試驗，發(fā)酵后復合果醋平均酸度為0.98 mol/L。紅心火龍果柚子復合果醋呈暗紅色、澄清透明、無雜質、無沉淀，具有火龍果和柚子的果香，酸甜適口，稍帶柚子的澀味，風味協(xié)調。近年來，我國紅心火龍果和柚子的種植高速發(fā)展，鮮果市場逐漸趨于飽和或過飽和狀態(tài)。隨著近年來人們生活水平不斷提高，對食品的要求也越來越高，追求健康性和養(yǎng)生性。通過復合果醋的研制，為紅心火龍果、柚子資源的開發(fā)和市場深加工，以及新型富營養(yǎng)果醋品種的開發(fā)提供了理論依據(jù)。