滿麗莉,向殿軍

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028042；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 通遼 028042)

血栓會(huì)導(dǎo)致心肌梗死、肺栓塞等疾病，近年來發(fā)病率和死亡率顯著上升，但目前常用的纖溶藥物具有作用時(shí)間短、價(jià)格高、來源受限、有出血風(fēng)險(xiǎn)等缺陷，開發(fā)新的纖溶藥物已成為亟待解決的問題[1,2]。納豆激酶具有安全、易吸收、作用時(shí)間長(zhǎng)、不易導(dǎo)致出血傾向、成本低廉和來源廣泛等眾多優(yōu)點(diǎn)，作為一種新型的溶血栓藥物備受關(guān)注[3-6]。中國(guó)傳統(tǒng)調(diào)味品是產(chǎn)納豆激酶菌株的良好來源，菌株的篩選是提高納豆激酶合成量的基礎(chǔ)和前提條件，有利于其工業(yè)化應(yīng)用，發(fā)酵培養(yǎng)基組成是影響納豆激酶合成量的主要因素之一[7]。大規(guī)模發(fā)酵的不確定性通常是由于對(duì)變量交互作用缺乏了解所導(dǎo)致的，響應(yīng)面法可在相對(duì)少的試驗(yàn)次數(shù)和較低的成本下研究各因素對(duì)納豆激酶合成的影響及變量間的交互作用，通過數(shù)學(xué)模型的構(gòu)建準(zhǔn)確描述整個(gè)過程[8]。本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中篩選并鑒定1株納豆激酶高產(chǎn)菌株，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法探討各因素之間的交互作用，確定最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品

供試樣品為自然發(fā)酵納豆、市售的豆豉及納豆。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

試劑：凝血酶，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；纖維蛋白原和瓊脂糖，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其他藥品，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.2～7.4。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，NaCl 0.5%，pH 7.2～7.4。

脫脂牛乳平板：5 g脫脂乳粉及1.5 g瓊脂分別溶于50 mL蒸餾水后分開滅菌，冷卻至50 ℃時(shí)混勻倒平板。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

SW-CT型超凈工作臺(tái) 鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；MJ-54A/MJ-78A型STIK滅菌鍋 北京天賜科儀商貿(mào)有限公司；BPH-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；Microfuge 16型離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司；WS-600型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 德國(guó)Wiggens公司；110-801型三量ip67防水原點(diǎn)數(shù)顯卡尺不銹鋼零點(diǎn)電子游標(biāo)尺 東莞市景有模具五金有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)及發(fā)酵方法

培養(yǎng)方法：挑取菌株接種于裝有50 mL基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37 ℃，180 r/min條件下震蕩培養(yǎng)12 h(OD600=1.5～1.6)。

發(fā)酵方法：將菌液按5%接種于裝有50 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37 ℃，180 r/min條件下震蕩培養(yǎng)72 h后，發(fā)酵液以5000×g離心10 min后，取10 μL上清液用于納豆激酶活性的測(cè)定。

1.2.2 納豆激酶活力的測(cè)定

納豆激酶活力的測(cè)定采用纖維蛋白平板法[9]。溶圈直徑采用電子游標(biāo)尺測(cè)定。

1.2.3 納豆激酶產(chǎn)生菌的篩選及鑒定

1.2.3.1 菌株的篩選

用10 mL無菌生理鹽水洗滌5～7粒納豆或豆豉，將洗滌液分裝于離心管中，5000×g，10 min離心后收集菌體，制備菌懸液，95 ℃水浴處理5 min，用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋菌懸液，取10-3，10-4，10-53個(gè)梯度分別吸取100 μL涂布于脫脂牛乳平板，37 ℃培養(yǎng)20 h，選擇透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌落挑菌，經(jīng)反復(fù)純化后保藏。挑取菌株按1.2.1方法培養(yǎng)發(fā)酵測(cè)定納豆激酶活性，篩選出溶圈直徑最大的菌株進(jìn)行鑒定及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。

1.2.3.2 菌株的鑒定

1.2.4 納豆激酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.4.1 碳源種類及濃度對(duì)納豆激酶合成的影響

運(yùn)用1%、2%、3%、4%的蔗糖、玉米淀粉、麩皮、可溶性淀粉分別代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中2%的葡萄糖，其他成分不變，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照。溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定溶圈直徑，選取適宜的碳源種類及其濃度。

1.2.4.2 氮源種類及濃度對(duì)納豆激酶合成的影響

運(yùn)用1%、2%、3%、4%的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、豆粕粉、硫酸銨分別代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中2%的蛋白胨，其他成分不變，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照。溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定溶圈直徑，選取適宜的氮源種類及其濃度。

1.2.4.3 無機(jī)鹽種類及濃度對(duì)納豆激酶合成的影響

通用電氣公司把企業(yè)文化視為最好的精神黏合劑，把公司所有人緊緊團(tuán)結(jié)在一起，向著共同的愿景目標(biāo)，協(xié)調(diào)一致，努力奮斗，從而把通用電氣打造成一個(gè)年輕而有活力的企業(yè)。韋爾奇告誡大家：“人才即是一切，有人才的公司才能成為最大的贏家。”“投資于人才”是通用電氣公司核心的管理文化——人才是企業(yè)的核心力量，優(yōu)秀人才是公司最重要的戰(zhàn)略資源，是企業(yè)價(jià)值的主要?jiǎng)?chuàng)造者。在人才全球化戰(zhàn)略的指引下，全球范圍內(nèi)尋找最優(yōu)秀的人才，挖掘有潛力的人才，留住一流的人才，挑選好接班人，始終是通用電氣公司最重要的戰(zhàn)略規(guī)劃。通用電氣公司的每一個(gè)企業(yè)都重用當(dāng)?shù)厝瞬?，同時(shí)注重培養(yǎng)其全球化工作能力，實(shí)現(xiàn)了人才的“全球本土化和本土全球化”。

采用不同濃度的K2HPO4∶KH2PO4(0.1%∶0.1%、0.2%∶0.1%、0.6%∶0.1%)、MnSO4·H2O(10-5，10-4，10-3mol/L)、CaCl2(0.02%、0.04%、0.06%)、MgSO4(0.02%、0.04%、0.06%)分別代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中0.5%的NaCl，其他成分不變，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照。溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定溶圈直徑，選取適宜的無機(jī)鹽種類及其濃度。

1.2.4.4 表面活性劑種類及濃度對(duì)納豆激酶合成的影響

運(yùn)用0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的吐溫40、吐溫80、羧甲基纖維素、聚乙二醇分別添加到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他成分不變，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照。溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定溶圈直徑，選取適宜的表面活性劑種類及其濃度。

1.2.4.5 響應(yīng)面法優(yōu)化納豆激酶發(fā)酵培養(yǎng)基

應(yīng)用Design-Expert軟件中的Box-Benhnken設(shè)計(jì)構(gòu)建模型，響應(yīng)面法尋找最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。以可溶性淀粉(A)、大豆蛋白胨(B)、氯化鈣(C)、硫酸鎂(D)、羧甲基纖維素(E)5個(gè)因素為自變量，溶圈直徑(mm)為響應(yīng)值，運(yùn)用五因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，共46個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中40個(gè)為析因子，6個(gè)為中心試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test %

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件中的One-Way Analysis of Variance(ANOVA)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。采用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Benhnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

運(yùn)用脫脂牛乳平板法從自然發(fā)酵納豆、市售的納豆及豆豉中初篩出60株蛋白酶產(chǎn)生菌株，采用纖維蛋白平板法從豆豉中復(fù)篩出1株納豆激酶活性顯著較高的菌株(P<0.01)，命名為菌株MX-6，溶圈直徑高達(dá)(21.60±0.48) mm。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)及菌體形態(tài)

圖1 菌株MX-6的菌落形態(tài)(a)及菌體形態(tài)(b)Fig.1 Colony morphology (a) and bacterial morphology (b) of strain MX-6

菌株MX-6的菌落呈白色，不規(guī)則圓形，邊緣呈波狀，有褶皺，中央凸起，不透明，無光澤(見圖1a)。顯微鏡觀察結(jié)果顯示菌株MX-6為革蘭氏染色陽性，菌體呈桿狀，兩端鈍圓，以單個(gè)或短鏈狀存在，芽孢為橢圓形，偏端生，芽孢囊無明顯膨大(見圖1b)。

2.2.2 生理生化鑒定

表2 菌株MX-6的生理生化鑒定Table 2 Physiological and biochemical identification of strain MX-6

由表2可知，菌株MX-6具有枯草芽孢桿菌屬的典型特征。

2.2.3 菌株MX-6的16S rDNA基因擴(kuò)增及同源性分析

圖2 菌株MX-6的DNA(a)及16S rDNA基因(b)Fig.2 DNA (a) and 16S rDNA gene (b) of strain MX-6

以菌株MX-6的總基因組DNA為模板(見圖2a)，應(yīng)用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增16S rDNA基因片段，獲得的序列片段長(zhǎng)度為1542 bp(見圖2b)，其序列與GenBank中已公布的枯草芽孢桿菌168(NR102783.1)的16S rDNA基因序列同源性高達(dá)99%以上，證明菌株MX-6為枯草芽孢桿菌。

2.3 不同碳源及濃度對(duì)納豆激酶活力的影響

表3 碳源對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6產(chǎn)納豆激酶的影響Table 3 Effect of carbon source on nattokinase produced by Bacillus subtilis MX-6

由表3可知，蔗糖、玉米淀粉、可溶性淀粉及2%的麩皮作為碳源均能顯著提高納豆激酶的合成量(P<0.01)，3%的可溶性淀粉作為碳源時(shí)，納豆激酶產(chǎn)量最高，溶圈直徑最大為，29.94 mm。

2.4 不同氮源及濃度對(duì)納豆激酶活力的影響

表4 氮源對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6產(chǎn)納豆激酶的影響Table 4 Effect of nitrogen source on nattokinase produced by Bacillus subtilis MX-6

由表4可知，胰蛋白胨、大豆蛋白胨、豆粕粉作為氮源均能顯著提高納豆激酶的合成量(P<0.01)，而硫酸銨作為氮源會(huì)降低納豆激酶的合成量(P<0.01)，2%的大豆蛋白胨作為氮源時(shí)，納豆激酶產(chǎn)量最高，溶圈直徑最大，為31.06 mm。

2.5 不同無機(jī)鹽及濃度對(duì)納豆激酶活力的影響

表5 無機(jī)鹽對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6產(chǎn)納豆激酶的影響Table 5 Effect of inorganic salt on nattokinase produced by Bacillus subtilis MX-6

由表5可知，MnSO4·H2O會(huì)顯著抑制納豆激酶的合成(P<0.01)，K2HPO4和KH2PO4對(duì)納豆激酶合成的影響不大(P>0.05)，而MgSO4和CaCl2有利于提高納豆激酶合成量(P<0.01)，兩者的添加量為0.04%時(shí)，溶圈直徑分別達(dá)到26.21 mm和26.82 mm。

2.6 不同表面活性劑及濃度對(duì)納豆激酶活力的影響

表6 表面活性劑對(duì)枯草芽孢桿菌 MX-6產(chǎn)納豆激酶的影響Table 6 Effect of surfactants on nattokinase produced by Bacillus subtilis MX-6

由表6可知，吐溫40、吐溫80、羧甲基纖維素和聚乙二醇有利于納豆激酶的合成(P<0.01)，添加0.4%的羧甲基纖維素時(shí)，納豆激酶產(chǎn)量最高，溶圈直徑最大，為29.13 mm。

2.7 響應(yīng)面法優(yōu)化納豆激酶發(fā)酵培養(yǎng)基

2.7.1 模型建立及顯著性分析

以溶圈直徑為響應(yīng)值，運(yùn)用Box-Benhnken設(shè)計(jì)46組實(shí)驗(yàn)(見表7)。二次回歸模型為：Y=-115.47771+14.91187A+9.75708B+1960.04167C+2093.20833D+196.8604-0.042500AB-26.25000AC-33.75000AD-0.25000AE+1.00000BC-22.75000BD-0.45000BE-2025.00000CD-50.00000CE-292.50000DE-2.12292A2-2.24208B2-22720.83333C2-22354.16667D2-231.95833E2。

式中：Y為抑菌圈直徑的預(yù)測(cè)值，A為可溶性淀粉的編碼值，B為大豆蛋白胨的編碼值，C為氯化鈣的編碼值，D為硫酸鎂的編碼值，E為羧甲基纖維素的編碼值。

表7 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Design and results of Box-Benhnken experiment

續(xù) 表

表8 二次模型的方差分析Table 8 Analysis of variance (ANOVA) for the quadratic model

注：“*”表示顯著(P<0.05)，“**”表示極顯著(P<0.01)；“-”表示不顯著。

由表8可知，該模型的P<0.01，表明試驗(yàn)所采取的二次模型極顯著。失擬項(xiàng)的P=0.1004>0.05，模型失擬項(xiàng)不顯著，決定系數(shù)R2=0.9925，表明模型與實(shí)際情況擬合度較高，所以可應(yīng)用該模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。該模型中A、B、C、D、E、AD、DE、A2、B2、C2、D2、E2的P<0.01，表明可溶性淀粉、大豆蛋白胨、氯化鈣、硫酸鎂、羧甲基纖維素、可溶性淀粉和硫酸鎂的交互作用、硫酸鎂和羧甲基纖維素的交互作用、可溶性淀粉的平方、大豆蛋白胨的平方、氯化鈣的平方、硫酸鎂的平方、羧甲基纖維素的平方對(duì)納豆激酶合成量的影響極顯著。AC、BD、CD的P<0.05，表明可溶性淀粉和氯化鈣、大豆蛋白胨和硫酸鎂、氯化鈣和硫酸鎂的交互作用對(duì)納豆激酶合成量的影響顯著。交互項(xiàng)AB、AE、BC、BE、CE的P>0.05，表明可溶性淀粉和大豆蛋白胨、可溶性淀粉和羧甲基纖維素、大豆蛋白胨和氯化鈣、大豆蛋白胨和羧甲基纖維素、氯化鈣和羧甲基纖維素的交互作用對(duì)納豆激酶合成量無顯著性影響。

2.7.2 響應(yīng)面分析

各因素的變化范圍分別為可溶性淀粉2%～4%，大豆蛋白胨1%～3%，氯化鈣0.03%～0.05%，硫酸鎂0.03%～0.05%，羧甲基纖維素0.30%～0.50%。在分別分析兩個(gè)因素之間的交互作用時(shí)，其中一個(gè)因素固定，隨著另一個(gè)因素濃度的增加，納豆激酶的合成量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)(見圖3)，說明各因素的最佳濃度在選定的范圍內(nèi)。優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉2.91%、大豆蛋白胨1.92%、氯化鈣0.04%、硫酸鎂0.04%、羧甲基纖維素0.39%。預(yù)測(cè)的溶圈直徑為33.84 mm。

圖3 兩兩因素之間的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface graphs between two factors

2.7.3 回歸模型的驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。實(shí)際溶圈直徑為(33.87±0.12) mm，與預(yù)測(cè)的溶圈直徑33.84 mm相比較差異不顯著(P>0.05)，表明該模型可靠性好。與優(yōu)化前的溶圈直徑(21.60±0.48) mm 相比較，溶圈直徑提高了56.81%，可見該模型能較好地預(yù)測(cè)納豆激酶的合成情況。

3 結(jié)論

由于納豆激酶的溶栓效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于彈性蛋白酶和纖溶酶，具有生產(chǎn)周期短、成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，使其成為研究熱點(diǎn)[9,10]。從中國(guó)豆豉中篩選獲得1株納豆激酶高產(chǎn)菌株MX-6，經(jīng)菌落形態(tài)、菌體形態(tài)和16S rDNA基因同源性分析鑒定為枯草芽孢桿菌，該菌株來源于中國(guó)傳統(tǒng)調(diào)味品，是農(nóng)業(yè)部和FDA認(rèn)定的安全性菌株，可用于研究其液體發(fā)酵合成納豆激酶，進(jìn)行溶栓藥物開發(fā)。提高納豆激酶合成量的主要途徑包括：篩選納豆激酶高產(chǎn)菌株；物理或化學(xué)誘變選育；優(yōu)化發(fā)酵條件或培養(yǎng)基。由于枯草芽孢桿菌在非適宜營(yíng)養(yǎng)條件下極易形成休眠體——芽孢，導(dǎo)致產(chǎn)酶終止，所以優(yōu)化培養(yǎng)基組成是顯著提高納豆激酶合成量的有效途徑之一[11,12]。本研究應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6產(chǎn)納豆激酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，獲得的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：可溶性淀粉2.91%、大豆蛋白胨1.92%、氯化鈣0.04%、硫酸鎂0.04%、羧甲基纖維素0.39%。在該發(fā)酵培養(yǎng)基中所產(chǎn)納豆激酶的溶圈直徑可高達(dá)33.87 mm，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值相比差異不顯著，表明響應(yīng)面模型的可行性和可靠性，所以本試驗(yàn)優(yōu)化獲得的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基切實(shí)可行，可為納豆激酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。