郭青，劉莉，周自桂，秦勇1，#（1.中國藥科大學中藥學院，南京11198；.江蘇神龍藥業(yè)股份有限公司，南京 10046）

琥珀酸索利那新（Solifenacin succinate），由日本安斯泰來制藥公司開發(fā)，2004年8月首次在歐洲上市，2004年11月獲美國FDA許可在美國上市，琥珀酸索利那新能夠抑制膀胱平滑肌收縮，且對尿頻、尿急、尿失禁有較好的改善作用[1-3]，與傳統(tǒng)的抗膽堿藥物相比，琥珀酸索利那新不良反應少、耐受性好[4-6]，在多個國家被列為治療膀胱過度活動癥（OAB）的首選用藥[7-8]。隨著中國老齡化現(xiàn)象日益明顯，OAB在中老年人群中發(fā)病率也越來越高，流行病學調查顯示，我國OAB的患病率約有6.0%[9]。隨著人們對OAB認知的增加，此類治療藥物將具有廣闊的市場前景。琥珀酸索利那新在《歐洲藥典》（EP）[10]和《美國藥典》（USP）[11]中均有收載，但由于合成路線差異，EP中僅對琥珀酸索利那新原料藥中的雜質A、C、D、I有所研究，李艷貞等[12]對琥珀酸索利那新原料藥中5個雜質進行研究，相關文獻[13-14]也僅對琥珀酸索利那新原料藥中部分雜質進行研究，未全面監(jiān)控琥珀酸索利那新原料藥合成過程中可能產(chǎn)生的工藝雜質和潛在的降解雜質。為更好控制琥珀酸索利那新原料藥質量，保證其用藥的安全性和有效性，筆者建立高效液相色譜（HPLC）-加校正因子的主成分自身對照法同時測定琥珀酸索利那新原料藥中7種有關物質的含量，為控制琥珀酸索利那新原料藥的質量提供參考。琥珀酸索利那新原料藥有關物質基本信息見表1。

1 材料

1.1 儀器

1260 HPLC儀，包括二極管陣列紫外檢測器、Openlab CDS色譜工作站（美國Agilent公司）；ALC-210千分之一分析天平、BT125D十萬分之一分析天平均購自德國Sartorius公司；FE20 pH計（瑞士Mettler-toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

琥珀酸索利那新原料藥（批號：171113、180117、180119、180502，純度：99.93%）、琥珀酸索利那新對照品（批號：171113，純度：99.93%）、雜質I對照品（批號：170817，純度：99.60%）、雜質J對照品（批號：171019，純度：99.80%）、雜質K對照品（批號：180328，純度：95.30%）均購自江蘇神龍藥業(yè)股份有限公司；雜質A對照品（批號：170402，純度：99.90%）、雜質L對照品（批號：161001，純度：96.80%）均購自成都新恒創(chuàng)藥業(yè)有限公司；雜質C對照品（批號：5-YDL-33-3，純度：93.68%）、雜質D對照品（批號：5-YDL-40-2，純度：96.00%）均購自加拿大TRC公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

表1 琥珀酸索利那新原料藥有關物質基本信息Tab 1 General information of related substance of solifenacin succinate raw material

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil ODS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.02 mol/L KH2PO4（含 0.2%三乙胺，pH 3.0）（A）-乙腈（B）溶液為流動相，梯度洗脫；流速：1.2 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。梯度洗脫程序見表2。

2.2 溶液的制備

2.2.1 琥珀酸索利那新原料藥供試品溶液 精密稱取琥珀酸索利那新原料藥10 mg，置于20 mL量瓶中，加溶劑（A與B以80∶20體積比混合而得，下同）溶解并定容，搖勻，即得。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedures

2.2.2 雜質對照品溶液 分別取雜質A、C、D、I、J、K、L對照品約12.5 mg，雜質L約1.87 mg，精密稱定，分別置于25 mL量瓶中，加溶劑溶解并稀釋制成雜質A、C、D、I、J、K質量濃度均為0.5 mg/mL，雜質L質量濃度為0.075 mg/mL的雜質對照品溶液。

2.2.3 琥珀酸索利那新對照品溶液 稱取琥珀酸索利那新對照品10 mg，置于20 mL量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，即得每1 mL中約含0.5 mg的琥珀酸索利那新對照品母液；精密量取1 mL琥珀酸索利那新對照品母液，置于50 mL量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻；再從中精密量取1 mL，置于20 mL量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得琥珀酸索利那新對照品溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗溶液 精密移取“2.2.2”項下雜質對照品溶液各1 mL，置于同一100 mL量瓶中，加溶劑稀釋制成雜質A、C、D、I、J、K質量濃度均為5 μg/mL，雜質L質量濃度為0.75 μg/mL的混合對照品貯備液；精密稱取琥珀酸索利那新原料藥10 mg，置于20 mL量瓶中，精密加入2 mL混合對照品貯備液，加溶劑溶解并定容，搖勻，即得系統(tǒng)適用性試驗溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取空白溶液（溶劑）和“2.2”項下琥珀酸索利那新原料藥供試品溶液、系統(tǒng)適用性試驗溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，主成分峰與雜質峰之間、各雜質峰之間分離度良好，且分離度均＞1.5，理論板數(shù)以雜質A峰計＞2 000。系統(tǒng)適用性試驗HPLC圖見圖1。

2.4 專屬性試驗

（1）酸破壞樣品溶液。取琥珀酸索利那新原料藥（批號：171113，下同）10 mg，置于20 mL量瓶中，加1 mol/L鹽酸溶液2 mL，于80℃水浴放置3 h后，放冷，加1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL中和，加溶劑溶解，定容，搖勻，即得。

（2）堿破壞樣品溶液。取琥珀酸索利那新原料藥10 mg，置于20 mL量瓶中，加1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，于80℃水浴放置3 h后，放冷，加1 mol/L鹽酸溶液2 mL中和，加溶劑溶解，定容，搖勻，即得。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗HPLC圖Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability test

（3）氧化破壞樣品溶液。取琥珀酸索利那新原料藥10 mg，置于20 mL量瓶中，加3%過氧化氫溶液2 mL，于80℃水浴放置1 h，放冷，加溶劑溶解，定容，搖勻，即得。

（4）高溫破壞樣品溶液。取琥珀酸索利那新原料藥適量，置于105℃烘箱中放置3 h，取出放冷，取10 mg，置于20 mL量瓶中，加溶劑溶解，定容，搖勻，即得。

（5）光照破壞樣品溶液。取琥珀酸索利那新原料藥10 mg，置于20 mL量瓶中，加溶劑溶解，置于強光照射試驗箱（4 500±500）lx照射24 h后取出，放至室溫，定容，搖勻，即得。

（6）未破壞樣品溶液。取琥珀酸索利那新原料藥10 mg，置于20 mL量瓶中，加溶劑溶解，定容，搖勻，即得。

取上述各樣品溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，琥珀酸索利那新原料藥在酸、高溫、光照條件下均較為穩(wěn)定，基本無降解產(chǎn)物產(chǎn)生，在堿破壞、氧化破壞條件下有不同程度的降解，主要生成雜質A、I、K。降解產(chǎn)物與主峰以及雜質峰間均能達到基線分離，且分離度均＞1.5，說明本法的專屬性較強。專屬性試驗HPLC圖見圖2。

2.5 線性關系考察

圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of specific test

精密量取“2.2.2”項下雜質對照品溶液和“2.2.3”項下琥珀酸索利那新對照品母液適量，分別用溶劑進行稀釋，即得雜質A質量濃度為0.148 1、0.246 8、0.394 8、0.493 5、0.592 2、0.740 3 μg/mL，雜質 C 質量濃度為0.142 9、0.238 2、0.381 0、0.476 3、0.571 6、0.714 5 μg/mL，雜質 D 質量濃度為 0.141 1、0.235 2、0.376 3、0.470 4、0.564 5、0.705 6 μg/mL，雜質I質量濃度為0.148 9、0.248 2、0.397 1、0.496 4、0.595 7、0.744 6 μg/mL，雜質J質量濃度為 0.152 0、0.253 3、0.405 3、0.506 6、0.607 9、0.759 9 μg/mL，雜質 K 質量濃度為 0.137 9、0.229 9、0.367 8、0.459 7、0.551 6、0.689 6 μg/mL，雜質 L 質量濃度為0.020 0、0.033 3、0.053 3、0.066 7、0.080 0、0.100 0 μg/mL，琥珀酸索利那新質量濃度為0.148 5、0.247 5、0.395 9、0.494 9、0.593 9、0.742 4 μg/mL的系列溶液。精密量取上述溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以雜質A、C、D、I、J、K、L和琥珀酸索利那新的質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，并以方程斜率（K）計算校正因子＝K琥珀酸索利那新/K雜質。琥珀酸索利那新和各雜質的回歸方程與校正因子見表3。

表3 琥珀酸索利那新和各雜質的回歸方程與校正因子Tab 3 Regression equation and correction factors of solifenacin succinate and impurities

2.6 定量限與檢測限考察

精密量取“2.2.2”項下雜質對照品溶液和“2.2.3”項琥珀酸索利那新對照品母液適量，逐級稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。以信噪比為10∶1計算定量限，以信噪比為3∶1計算檢測限。結果，琥珀酸索利那新和雜質A、C、D、I、J、K、L的定量限分別為0.148 5、0.148 1、0.142 9、0.141 1、0.148 9、0.152 0、0.137 9、0.020 0 μg/mL，檢測限分別為0.049 5、0.049 3、0.047 6、0.047 0、0.048 1、0.050 7、0.046 0、0.006 7 μg/mL。

2.7 精密度試驗

取“2.2.4”項下系統(tǒng)適用性試驗溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果，琥珀酸索利那新和雜質A、C、D、I、J、K、L峰面積的RSD分別為1.01%、0.61%、0.57%、0.66%、0.75%、0.69%、0.61%、1.06%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.4”項下系統(tǒng)適用性試驗溶液適量，分別于室溫下放置0、5、10、15、20、24 h 后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，琥珀酸索利那新和雜質A、C、D、I、J、K、L峰面積的RSD均＜5.0%（n＝6），表明系統(tǒng)適用性溶液在室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.9 重復性試驗

按“2.2.4”項下系統(tǒng)適用性試驗溶液制備方法制備供試品溶液共6份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，琥珀酸索利那新和雜質A、C、D、I、J、K、L峰面積的RSD分別為0.76%、1.51%、1.12%、0.93%、1.10%、2.32%、2.08%、2.86%（n＝6），表明本試驗重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗

精密稱取琥珀酸索利那新原料藥（批號：171113）10 mg，置于20 mL量瓶中，共9份，分別加入“2.2.4”項下溶液1.6、2.0、2.4 mL，再用溶劑稀釋至刻度，即得分別相當于雜質限度為80%、100%和120%的供試品溶液。取上述供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以加校正因子的主成分自身對照法計算各雜質回收率。結果，雜質A、C、D、I、J、K、L的平均回收率分別為101.09%、97.58%、93.77%、98.56%、99.68%、97.07%、93.54%，RSD分別為0.75%、0.51%、0.47%、0.84%、0.70%、0.75%、1.21%（n＝9）?；厥章蕼y定結果見表4。

表4 回收率測定結果（n＝9）Tab 4Results of recovery tests（n＝9）

續(xù)表4Continued tab 4

2.11 樣品中有關物質測定

取琥珀酸索利那新原料藥3批，按“2.2.1”項下方法制備溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按加校正因子的主成分自身對照法計算各雜質的含量。結果，3批琥珀酸索利那新原料藥中雜質I含量為0.015%～0.018%，其余雜質未檢出。琥珀酸索利那新原料藥中有關物質檢測結果見表5。

表5 琥珀酸索利那新原料藥中有關物質檢測結果（%%）Tab 5 Results of related substance determination in solifenacin succinate raw material（%%）

3 討論

3.1 色譜條件選擇

琥珀酸索利那新原料藥在儲存過程中可能會氧化降解產(chǎn)生雜質K，雜質L是潛在基因毒雜質，限度較低，需要較高的檢測靈敏度；雜質J是合成過程中可能產(chǎn)生的工藝雜質，上述雜質在EP、USP中均未進行研究。筆者在前期比較了EP、USP對琥珀酸索利那新原料藥中的有關物質的研究，EP中的方法對實驗室條件要求苛刻，方法適用性有限，USP中的方法使主峰峰形欠佳；鑒于本研究中的幾個雜質極性相差較大，無法采用現(xiàn)有標準的檢測方法進行分析，經(jīng)筆者前期篩選優(yōu)化，以0.02 mol/L的KH2PO4（含0.2%三乙胺，pH 3.0）-乙腈溶液為流動相進行梯度洗脫時，能有效檢出琥珀酸索利那新原料藥在合成路徑或降解途徑中可能產(chǎn)生的雜質，且雜質之間、主成分峰與相鄰雜質峰之間均能有效分離，且經(jīng)驗證表明，優(yōu)化的色譜條件適用于本品有關物質測定。

3.2 波長、柱溫、流動相的選擇

筆者在前期試驗中，分別考察在一定范圍內改變檢測波長（205～215 nm）、柱溫（35～45℃）、初始流動相中乙腈比例（18%～22%）、流動相中三乙胺溶液濃度（0.18%～0.22%）、pH值（2.8～3.2）是否滿足系統(tǒng)適用性和靈敏度要求，同時考察在一定范圍內色譜條件改變對樣品測定結果的影響。研究發(fā)現(xiàn)，流動相pH為2.8時，雜質L與相鄰溶劑峰之間分離度欠佳，pH為2.9時分離度符合要求，pH為3.0時分離效果最佳；其他各考察條件在一定范圍內改變對供試品檢測無影響。

3.3 各雜質限度擬定

根據(jù)人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調會議（ICH）的指導原則[15]，結合各國藥典規(guī)定的各雜質限度，擬定琥珀酸索利那新雜質限度為雜質A、C、D、I、J、K均不得超過0.1%，雜質I不得超過0.015%，總雜不得超過0.3%。

綜上所述，本研究建立的HPLC-加校正因子的主成分自身對照法靈敏、準確、可靠，可同時測定琥珀酸索利那新原料藥中7種有關物質的含量，可為琥珀酸索利那新原料藥的質量控制提供參考。