烏 素，班 瑞，楊曉艷，李少英

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E.coli），又稱大腸桿菌，是腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、埃希氏菌屬 （Escherichia） 的代表菌。因Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)而得名[1]，因其具有結(jié)構(gòu)簡單、需要的營養(yǎng)物質(zhì)簡單、易于培養(yǎng)、繁殖速度快、分布廣等特點(diǎn)，無論在科學(xué)試驗(yàn)研究中，還是在食品安全和相關(guān)疾病研究中，常作為載體菌、指示菌、病原菌備受廣大科研工作者的關(guān)注[2]。如何快速檢測樣品中的大腸桿菌是研究者幾十年來一直亟待解決的問題，特別是大腸桿菌生長過程中的形態(tài)、染色特性等基本內(nèi)容[1]。試驗(yàn)通過革蘭氏染色的方法，對培養(yǎng)8～24 h大腸桿菌的形態(tài)特征進(jìn)行研究，對今后更好地控制和利用大腸桿菌，具有指導(dǎo)意義和參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株：Escherichia coli ATCC：25922（大腸桿菌），購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，以下命名為E.coli-1。

試驗(yàn)菌株：來自于實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，以下命名為E.coli-2。

1.1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

KDC-140HR型高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；CP522C型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；WPL-230BE型電熱恒溫培養(yǎng)箱、BBS-SDC型潔凈工作臺(tái)，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；GR60DA型立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器，致微（廈門）儀器有限公司產(chǎn)品；DM500+ICC50Leica型顯微鏡，德國徠卡儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 試驗(yàn)藥品

革蘭氏染色液，南京建成生物工程研究所提供；胰蛋白胨（生化試劑），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；酵母提取粉（生化試劑），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供；瓊脂（生化試劑），天津市英博生化試劑有限公司提供；氯化鈉（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司提供。

1.1.4 培養(yǎng)基的調(diào)配

①LB液體培養(yǎng)基的配制。胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，攪拌均勻，調(diào)pH值為7.4。②LB固體培養(yǎng)基的配制。將LB液體培養(yǎng)基調(diào)pH值后，再加入瓊脂15 g，加熱、攪拌至沸騰。將配置好的LB液體培養(yǎng)基分裝到試管中，固體培養(yǎng)基分裝到錐形瓶內(nèi)，于121℃滅菌20 min[3]。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化與保藏

將大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，如此再重復(fù)2次，穿刺保藏于LB半固體培養(yǎng)基中，37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，于4℃保藏不同時(shí)間，備用。

1.2.2 不同生長階段形態(tài)的研究

分別對培養(yǎng)8～24 h的大腸桿菌進(jìn)行涂片染色，中間每2 h涂1次片，觀察形態(tài)并記錄。

1.2.3 供試菌液制備

將保藏的大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，活化到三代，于37℃下恒溫培養(yǎng)24h，以轉(zhuǎn)速3000r/min離心10 min，棄去上清液，用生理鹽水洗滌（每次5 mL，反復(fù)離心洗滌3次），即得供試菌液[4]。

1.2.4 涂片的制備、干燥與固定

（1）涂片。采用傳統(tǒng)常規(guī)涂菌[4]。試驗(yàn)將待觀察的大腸桿菌培養(yǎng)8～24 h，每隔2 h從37℃恒溫箱中取出1試管的菌液進(jìn)行離心（以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min），然后將離心好的菌泥在超凈臺(tái)中用接種環(huán)從離心管中挑起滿環(huán)或者半環(huán)進(jìn)行涂片。

（2）干燥。將涂片放到滅菌的超凈臺(tái)中，于室溫下進(jìn)行干燥[4]。

（3）固定。采用火焰固定法。

1.2.5 革蘭氏染色

初染（草酸銨結(jié)晶紫） 設(shè)定了1，2，3 min；媒染（革蘭氏碘液） 1 min；脫色（95%的乙醇） 設(shè)定了30 s和1，2，3 min；復(fù)染（番紅染色液） 1 min。步驟采用傳統(tǒng)染色法[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間大腸桿菌形態(tài)特征

將大腸桿菌活化2代，將第3代菌分別培養(yǎng)8，10，12，14，16，18，20，22，24 h，并分別對其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)革蘭氏染色，用油鏡（100×）進(jìn)行觀察。

大腸桿菌E.coli-1，E.coli-2培養(yǎng)8～24 h的形態(tài)特征見表1。

由表1可知，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的四步革蘭氏染色法對菌體進(jìn)行涂片染色后，大腸桿菌都呈現(xiàn)紅色。其中培養(yǎng)8～16 h的大腸桿菌呈現(xiàn)短桿狀比較明顯，到了18～24 h大腸桿菌的形態(tài)變得無規(guī)則。這是因?yàn)榧?xì)菌在適宜的培養(yǎng)條件下，一般十幾個(gè)小時(shí)即進(jìn)入對數(shù)生長期。如果菌齡過長，菌體會(huì)出現(xiàn)異常形態(tài)[6]。

表1 大腸桿菌E.coli-1，E.coli-2培養(yǎng)8～24 h的形態(tài)特征

2.2 草酸銨結(jié)晶紫初染時(shí)間對大腸桿菌形態(tài)觀察的影響

用草酸銨結(jié)晶紫對培養(yǎng)16 h的大腸桿菌E.coli-1進(jìn)行染色1～3 min，每種情況涂片10張。

草酸銨結(jié)晶紫染色1 min見圖1，草酸銨結(jié)晶紫染色2 min見圖2，草酸銨結(jié)晶紫染色3 min見圖3。

圖1 草酸銨結(jié)晶紫染色1 min

由圖1～圖3可知，草酸銨結(jié)晶紫對大腸桿菌染色1～3 min的染色效果是相同的，所以在染色時(shí)采用草酸銨結(jié)晶紫染色1 min，可以節(jié)省染色所消耗的時(shí)間。

2.3 酒精脫色時(shí)間對大腸桿菌形態(tài)觀察的影響

用培養(yǎng)16 h的大腸桿菌E.coli-1涂片分別進(jìn)行1，2，3 min不同脫色時(shí)間試驗(yàn)，每種情況涂片10張。

脫色1 min見圖4，脫色2 min見圖5，脫色3 min見圖6。

由圖4～圖6可知，由于涂片時(shí)涂菌厚度較一般涂片厚，因此在酒精脫色的過程中時(shí)間從30 s延長至1，2，3 min進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)，酒精脫色3 min時(shí)觀察效果最佳，所以其余涂片染色時(shí)都把酒精脫色延長至3 min。同時(shí)應(yīng)減少取菌量，降低細(xì)菌堆積密度，以防涂片菌膜濃厚時(shí)會(huì)因大腸桿菌密集成堆而不易脫色或脫色不完全，呈現(xiàn)假陽性反應(yīng)[7-9]；而如果涂片太薄、大腸桿菌數(shù)量太少，觀察時(shí)難以尋找到合適視野[10]，所以涂片厚度也應(yīng)該保持適中。

圖2 草酸銨結(jié)晶紫染色2 min

圖3 草酸銨結(jié)晶紫染色3 min

圖4 脫色1 min

圖5 脫色2 min

圖6 脫色3 min

2.4 番紅復(fù)染時(shí)間對大腸桿菌形態(tài)觀察的影響

用培養(yǎng)16 h的大腸桿菌E.coli-1涂片分別進(jìn)行復(fù)染1，2，3 min試驗(yàn)，每種情況涂片10張。

番紅染色1 min見圖7，番紅染色2 min見圖8，番紅染色3 min見圖9。

圖7 番紅染色1 min

圖8 番紅染色2 min

圖9 番紅染色3 min

由圖7～圖9可知，當(dāng)番紅對大腸桿菌進(jìn)行1～3 min染色時(shí)，其染色效果相同，所以在給大腸桿菌進(jìn)行番紅染色時(shí)，選擇染色1 min，這樣既可以對大腸桿菌進(jìn)行染色觀察，又縮短了對大腸桿菌的整體染色時(shí)間。

3 結(jié)論

大腸桿菌在培養(yǎng)8～16 h時(shí)，形態(tài)特征表現(xiàn)明顯，呈現(xiàn)短桿狀；到了18～24 h形態(tài)變得無規(guī)則。草酸銨結(jié)晶紫初染和番紅復(fù)染對革蘭氏染色結(jié)果影響較小，乙醇脫色時(shí)間對革蘭氏染色結(jié)果有較大影響，在對菌體染色過程中，應(yīng)注意控制好菌齡和脫色時(shí)間[11-12]，才能得到正確的染色結(jié)果，以便于正確區(qū)分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，進(jìn)而可幫助臨床對食物中毒原因及所用藥物做出正確選擇[5]。