熊世進(jìn),高文功,楊菲菲,趙雪婷,秦小彤,杜同浩,熊 濤,*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047; 2.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌 330031; 3.修益升益生菌國(guó)際研究院,香港 999077)

益生菌是攝入足夠的量時(shí)會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生諸多健康益處的一類活的微生物[1]。研究發(fā)現(xiàn),益生菌對(duì)多種疾病包括炎癥性腸病、腸應(yīng)激綜合征、急性腹瀉、高血壓、糖尿病和便秘等都具有預(yù)防或緩解作用[2]。富含益生菌的功能性食品具有抗癌、降血糖、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性作用[3]。研究表明益生菌通過(guò)黏附作用定植于宿主腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells,IECs),逐步形成生物膜并產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物,從而構(gòu)成一層天然的保護(hù)屏障,對(duì)宿主產(chǎn)生多種生理功效。對(duì)于外源的益生菌制劑來(lái)說(shuō),能否在腸道黏附和定植是評(píng)價(jià)其效果的主要指標(biāo)之一[4]。因此,益生菌黏附并定植于宿主腸上皮細(xì)胞上是發(fā)揮其益生作用的前提。

益生菌對(duì)宿主IECs黏附作用可大致分為兩個(gè)過(guò)程。第一步是可逆的非特異性黏附,此階段是細(xì)菌趨近于宿主細(xì)胞的過(guò)程,主要由靜電力、疏水相互作用、空間位阻、范德華力和溫度等物理化學(xué)參數(shù)決定;第二步則是由分子介導(dǎo)的細(xì)菌表面特異性黏附素與宿主細(xì)胞表面特異性受體之間的結(jié)合,該過(guò)程一般是不可逆的[5]。益生菌對(duì)宿主IECs的黏附是由多種因素共同作用的結(jié)果,概括起來(lái)可分為內(nèi)因和外因。內(nèi)因主要指細(xì)菌的生理狀態(tài)、生長(zhǎng)階段、菌體濃度、細(xì)胞壁組成等;外因主要是指一些環(huán)境條件,包括離子濃度(Ca2+、Mg2+等)、pH、溫度等[5]。此外,一些研究認(rèn)為，細(xì)菌疏水性和自凝集作用在細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附過(guò)程中起著重要作用，甚至與細(xì)菌的黏附呈一定的相關(guān)性[6-7]。

細(xì)菌的自凝集在生物膜的形成中起著重要作用,而且有助于益生菌在腸道的定植并防止致病菌的黏附[8];它是物理和化學(xué)因素相互作用的結(jié)果,其作用機(jī)制目前還不是十分清楚;大而重的菌體細(xì)胞會(huì)沉降的更快,但細(xì)胞表面電荷和表面組分是影響自凝集主要因素[9]。

細(xì)菌表面疏水性(cell surface hydrophobicity,CSH)被定義為表面具有非極性成分的細(xì)菌在具有極性性質(zhì)的水中所表現(xiàn)出的非穩(wěn)態(tài),從而引起非穩(wěn)態(tài)體系中的熱能和分子的重新排列[10]。研究表明,益生菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附是通過(guò)強(qiáng)疏水相互作用參與的一個(gè)過(guò)程,菌株表現(xiàn)出強(qiáng)的表面疏水性有助于黏附的發(fā)生[11]。當(dāng)疏水率>60%時(shí),菌株被認(rèn)為是高度疏水的,當(dāng)疏水率40%～60%時(shí),菌株被認(rèn)為是中度疏水的,當(dāng)疏水率<40%時(shí)菌株是親水的[12]。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者通常只采用某一種細(xì)胞模型考察益生菌的黏附性或只通過(guò)自凝集和疏水性間接反映益生菌黏附性。益生菌的黏附存在宿主細(xì)胞特異性,自凝集和疏水性與黏附性間的相關(guān)性尚存在一定的爭(zhēng)議,因此本實(shí)驗(yàn)意在探討益生菌的自凝集能力、疏水性及細(xì)胞黏附能力之間的相關(guān)性。由于體內(nèi)黏附實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展較為困難,現(xiàn)廣泛采用HT-29、Caco-2和HT-29-MTX等體外細(xì)胞黏附模型來(lái)近似模擬宿主體內(nèi)益生菌的黏附定植情況[13]。本研究同時(shí)采用人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和Caco-2作為體外模型并結(jié)合益生菌的疏水性及自凝集特性考察六株益生菌的黏附能力;同時(shí)以HT-29細(xì)胞作為體外模型,探究不同因素對(duì)發(fā)酵乳桿菌CECT5716黏附能力的影響,從而更為全面地考察益生菌的黏附能力及影響其黏附能力的因素,為其在食品、藥品和保健品等行業(yè)中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)酵乳桿菌CECT5716、副干酪乳桿菌MP-137、鼠李糖乳桿菌MP-108、嗜酸乳桿菌F-1、乳雙歧桿菌AD011和長(zhǎng)雙歧桿菌BLI-02 修益升益生菌國(guó)際研究院;人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29 南昌大學(xué)前湖醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng);人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2 南昌大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;DMEM培養(yǎng)液、1×PBS緩沖液(phosphate buffered saline,pH7.2)、優(yōu)級(jí)胎牛血清 賽澳美細(xì)胞技術(shù)(北京)有限公司;胰蛋白酶-EDTA消化液 北京索萊寶科技有限公司;二甲苯 天津大茂化學(xué)試劑廠。

YXQ-LS-50SⅡ/75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;DWS-DG250厭氧工作站 華粵行儀器有限公司;CO2培養(yǎng)箱 長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司;生物安全柜 蘇凈集團(tuán)安泰公司;DNP-9272型生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Thermo-ST16R高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾(中國(guó))科技有限公司;37XC倒置生物顯微鏡 上海光學(xué)儀器進(jìn)出口有限公司;Olympus-CX31正置光學(xué)生物顯微鏡 上海維翰光電科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)液的配制及用途 DMEM不完全培養(yǎng)液(含1%谷氨酰胺)用于益生菌與結(jié)腸癌細(xì)胞系的黏附實(shí)驗(yàn);DMEM完全培養(yǎng)液(含有1%青霉素和鏈霉素、1%谷氨酰胺、1%的非必需氨基酸以及10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清)用于HT-29及Caco-2細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng);MRS培養(yǎng)基用于乳桿菌的培養(yǎng);改良MRS培養(yǎng)基(補(bǔ)充有0.05%的L-半胱氨酸鹽酸鹽)用于雙歧桿菌的培養(yǎng)。

1.2.2 微生物的培養(yǎng)與保存 六株益生菌菌粉在相應(yīng)MRS液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)15 h,連續(xù)活化三次后在相應(yīng)MRS平板上進(jìn)行劃線,37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h,觀察并記錄菌落形態(tài),進(jìn)行革蘭氏染色。所有菌種均取對(duì)數(shù)期菌懸液500 μL和50%的滅菌甘油按1∶1 (v/v)保存于-80 ℃下。

1.2.3 人結(jié)腸癌細(xì)胞的培養(yǎng) 將HT-29和Caco-2細(xì)胞凍存管從液氮罐中取出,于水浴鍋中迅速融化后,分別置于50 mL 25 cm2培養(yǎng)瓶中,各加入5 mL新鮮DMEM完全培養(yǎng)基,在二氧化碳培養(yǎng)箱中(95%空氣和5% CO2)37 ℃下培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好后(約70%～80%融合),用胰蛋白酶-EDTA消化液消化傳代[14-15]。通常HT-29細(xì)胞每天換液,隔天傳代;Caco-2細(xì)胞隔天換液,每4 d傳代一次。

1.2.4 菌懸液制備 六株益生菌活化后挑取單菌落分別于相應(yīng)MRS液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)12～14 h作為種子液,再以2%(v/v)的接種量接種于50 mL MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃過(guò)夜培養(yǎng),室溫4500 r/min離心10 min收集菌體,無(wú)菌PBS緩沖液洗滌兩次后重懸,以乳酸菌活菌計(jì)數(shù)法[16]快速測(cè)定菌懸液中菌體數(shù)量,最后使用無(wú)菌PBS調(diào)整至所需菌體濃度。

1.2.5 自凝集能力的測(cè)定 將過(guò)夜培養(yǎng)的益生菌在室溫4500 r/min下離心10 min收集菌體,并用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌兩次。隨后,將獲得的菌體細(xì)胞用無(wú)菌PBS重懸并調(diào)整A600至0.6±0.05(A0),在37 ℃孵育24 h。在第2、4、6、12和24 h時(shí)取上層菌懸液,于600 nm下測(cè)定吸光度(At),每次測(cè)定三個(gè)平行[17-18]。按照下式計(jì)算細(xì)菌的自凝集百分比。

其中:A0表示菌體初始吸光值,At代表t時(shí)刻上層菌懸液的吸光值。

1.2.6 疏水性測(cè)定 根據(jù)Bautista-Gallego等[19]的方法并略作改動(dòng)。利用微生物黏著碳?xì)浠衔锓?bacteria adhesion to hydrocarbons,BATH)進(jìn)行益生菌表面疏水性的測(cè)定。首先將過(guò)夜培養(yǎng)的益生菌在4500 r/min下離心10 min收集菌體細(xì)胞,并用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌兩次;隨后,將獲得的菌體細(xì)胞用無(wú)菌PBS重懸并調(diào)整A600至0.6±0.05(A0)。然后取1 mL二甲苯加入至3 mL調(diào)整好濃度的菌體細(xì)胞懸液中,混合后在室溫下預(yù)孵育10 min,渦旋振蕩2 min,然后在室溫下孵育30 min分層,小心吸取水相,以無(wú)菌PBS為空白測(cè)定A600值(A)。按下式計(jì)算細(xì)菌的疏水性：

其中:A0表示菌體初始吸光值;A為二甲苯處理后下層水相吸光值。

1.2.7 益生菌對(duì)模擬腸上皮細(xì)胞的黏附性 將培養(yǎng)好的HT-29或Caco-2細(xì)胞用胰酶-EDTA消化液消化,再用DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105個(gè)/mL,裝于6孔組織培養(yǎng)板中,每孔2 mL,于CO2培養(yǎng)箱(5% CO2、95%空氣)中37 ℃孵育至細(xì)胞長(zhǎng)至單層。棄去組織培養(yǎng)板中各孔的DMEM培養(yǎng)液,以無(wú)菌PBS緩沖液清洗培養(yǎng)板2遍,其中1孔用0.4 mL胰酶-EDTA消化液進(jìn)行消化后,加入0.6 mL PBS緩沖液,用巴氏吸管吹打,將細(xì)胞完全消化并使之混合均勻,采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞濃度。其他5孔分別加入1 mL DMEM不完全培養(yǎng)液、1 mL益生菌菌懸液(108CFU/mL),用移液槍吹打混勻,于37 ℃孵育2 h。孵育后棄去組織培養(yǎng)板中各孔的混合液,用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌5次,以除去未黏附的菌體。加入0.4 mL胰酶-EDTA消化液進(jìn)行消化后加入0.6 mL無(wú)菌PBS緩沖液,進(jìn)行梯度稀釋,涂布于MRS固體平板上計(jì)算黏附的細(xì)菌數(shù)[14,20]。黏附能力用下式計(jì)算：

鑒于發(fā)酵乳桿菌CECT5716已經(jīng)是被廣泛認(rèn)可的優(yōu)良益生菌株,它具有極大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,并綜合考慮六株益生菌的表面性質(zhì)和黏附特性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇發(fā)酵乳桿菌CECT5716進(jìn)行黏附能力影響因素的考察。

1.2.8 不同因素對(duì)發(fā)酵乳桿菌CECT5716黏附能力的影響

1.2.8.1 生長(zhǎng)階段對(duì)黏附能力的影響 分別取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(16 h)、穩(wěn)定期(24 h)和衰亡期(36 h)的發(fā)酵乳桿菌CECT5716發(fā)酵液,室溫離心收集菌體(4500 r/min,10 min),無(wú)菌PBS洗滌2次，并以該緩沖液調(diào)整菌體濃度至108CFU/mL,分別與HT-29細(xì)胞共孵育2.0 h,計(jì)算其黏附能力。

1.2.8.2 菌體濃度對(duì)黏附能力的影響 取培養(yǎng)至24 h的發(fā)酵乳桿菌CECT5716發(fā)酵液,離心收集菌體(4500 r/min,10 min),無(wú)菌PBS洗滌兩次并以該緩沖液調(diào)整菌體濃度至105、106、107、108、109CFU/mL,之后分別與HT-29細(xì)胞共孵育2.0 h,計(jì)算其黏附能力。

1.2.8.3 共孵育時(shí)間對(duì)發(fā)黏附能力的影響 取培養(yǎng)至24 h的發(fā)酵乳桿菌CECT5716發(fā)酵液,離心收集菌體(4500 r/min,10 min),無(wú)菌PBS洗滌兩次并以該緩沖液調(diào)整菌體濃度至108CFU/mL,分別與HT-29細(xì)胞共孵育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,計(jì)算其黏附能力。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果

如表1所示,六株益生菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體基本都呈桿狀，菌落形態(tài)各異。

表1 六株益生菌菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果Table 1 Colony morphology and microscopic observation results of six probiotics

2.2 益生菌的自凝集能力

由圖2可知,六株益生菌的自凝集率隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,在24 h時(shí)達(dá)到最大值,此時(shí)嗜酸乳桿菌F-1的自凝集率最高,為69.92%,這可能與其菌體較大有關(guān);其次是長(zhǎng)雙歧桿菌BLI-02,達(dá)62.43%,鼠李糖乳桿菌MP-108、乳雙歧桿菌AD011、副干酪乳桿菌MP-137和發(fā)酵乳桿菌CECT5716的自凝集率分別為51.14%、55.43%、53.40%和43.55%。此外,發(fā)酵乳桿菌CECT5716在前2 h內(nèi)快速凝集,而其余五株菌主要在前6 h內(nèi)迅速凝集。不同的益生菌在24 h時(shí)自凝集率存在顯著性差異(p<0.05),表明益生菌的自凝集作用具有菌種特異性,這也與其他研究人員[21-23]結(jié)論相一致。

圖1 六株益生菌的革蘭氏染色(1000×), Fig.1 Gram staining of six probiotics(1000×)注:A:發(fā)酵乳桿菌CECT5716;B:嗜酸乳桿菌F-1;C:鼠李糖乳桿菌MP-108; D:長(zhǎng)雙歧桿菌BLI-02;E:乳雙歧桿菌AD011;F:副干酪乳桿菌MP-137。

圖2 益生菌在2、4、6、12和24 h后的自凝集率Fig.2 Auto-aggregation percentages of the probiotics after 2,4,6,12 and 24 h注:不同的字母表示各組間存在顯著差異(p<0.05),圖3～圖7同。

2.3 益生菌的疏水性

六株益生菌疏水性大小如圖3所示,其中疏水性最強(qiáng)的是鼠李糖乳桿菌MP-108,達(dá)到90.10%;其次則是乳雙歧桿菌AD011和嗜酸乳桿菌F-1,其疏水率分別達(dá)81.18%和76.82%;發(fā)酵乳桿菌CECT5716、副干酪乳桿菌MP-137和長(zhǎng)雙歧桿菌BLI-02的疏水率分別為65.41%、27.10%、和1.83%,其中鼠李糖乳桿菌MP-108、乳雙歧桿菌AD011、嗜酸乳桿菌F-1和發(fā)酵乳桿菌CECT5716的疏水率大于60%,可被認(rèn)為是高度疏水性菌株,而且除乳雙歧桿菌AD011與嗜酸乳桿菌F-1間疏水性大小不存在顯著性差異(p<0.05),其余菌株間均存在顯著差異(p<0.05),同樣表明益生菌株的疏水性具有菌種特異性,這與Saini等[21]、Oh等[24]研究結(jié)果,具有一致性。

圖3 不同益生菌的疏水性大小Fig.3 Hydrophobicity of the different probiotics

2.4 益生菌對(duì)不同結(jié)腸癌細(xì)胞的黏附能力

益生菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附是其在宿主體內(nèi)發(fā)揮多種生理功能的重要基礎(chǔ),也是篩選益生菌的一個(gè)首要考慮因素[25]。益生菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附性如圖4所示,乳雙歧桿菌AD011顯示出最高的黏附能力,為(42.80±0.68) CFU/cell;其次是副干酪乳桿菌MP-137和鼠李糖乳桿菌MP-108,分別達(dá)到(19.30±2.03)、(16.69±0.70) CFU/cell;其余三株菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附性較低(均低于1 CFU/cell),發(fā)酵乳桿菌CECT5716為(0.27±0.02) CFU/cell、嗜酸乳桿菌F-1為(0.50±0.10) CFU/cell、長(zhǎng)雙歧桿菌 BLI-02為(0.27±0.03) CFU/cell,而且這三株菌之間無(wú)顯著差異(p>0.05)。陳臣[26]研究了4株乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附性,其中鼠李糖乳桿菌GG為(16.11±1.57) CFU/cell,低于本研究中乳雙歧桿菌AD011、副干酪乳桿菌 MP-137和鼠李糖乳桿菌MP-108的黏附能力。

圖4 不同益生菌對(duì)Caco-2和HT-29細(xì)胞的黏附性大小Fig.4 Adhesion to Caco-2 and HT-29 cells of the different probiotics

如圖4所示,六株益生菌對(duì)HT-29細(xì)胞的平均黏附能力分布在1.95～47.01 CFU/cell之間,其中以乳雙歧桿菌AD011的黏附性最強(qiáng),為(47.01±0.20) CFU/cell;其次是長(zhǎng)雙歧桿菌BLI-02,黏附能力達(dá)(33.57±0.82) CFU/cell;嗜酸乳桿菌F-1、副干酪乳桿菌MP-137、發(fā)酵乳桿菌CECT5716以及鼠李糖乳桿菌MP-108對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附能力分別為(6.12±0.53)、(6.30±0.68)、(3.61±0.20)和(1.95±0.29) CFU/cell。魏銀萍等[27]研究了培菲康制劑中3種益生菌對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附能力,結(jié)果顯示嗜酸乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和糞腸球菌的平均黏附能力分別約為5.01、4.41和1.63 CFU/cell,低于本研究中的乳雙歧桿菌AD011、長(zhǎng)雙歧桿菌BLI-02、嗜酸乳桿菌 F-1和副干酪乳桿菌MP-137的黏附性。

不同的益生菌對(duì)HT-29細(xì)胞以及Caco-2細(xì)胞顯示出差異化的黏附能力,說(shuō)明益生菌對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的黏附存在菌種特異性,這也與諸多研究[9,22,28]中的結(jié)論相符。此外,同一菌株對(duì)不同結(jié)腸癌細(xì)胞的黏附能力同樣具有明顯差異,如長(zhǎng)雙歧桿菌BLI-02對(duì)HT-29細(xì)胞黏附能力達(dá)(33.57±0.82) CFU/cell,而對(duì)Caco-2的黏附只有(0.27±0.03) CFU/cell,鼠李糖乳桿菌MP-108對(duì)HT-29和Caco-2細(xì)胞黏附能力分別為(1.95±0.29)、(19.30±2.03) CFU/cell。Ribeiro等[29]的研究表明植物乳桿菌L2C21E8和L3C1E8對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附性要明顯強(qiáng)于對(duì)HT-29;類似地,Lazado等[18]在考察潛在益生菌株GP21和 GP12對(duì)鱈魚(yú)不同腸段細(xì)胞的黏附性時(shí)發(fā)現(xiàn),菌株GP12傾向于粘附前腸和中腸段細(xì)胞,菌株GP21則更傾向于黏附后腸段細(xì)胞,均表明益生菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附存在宿主特異性。

2.5 不同因素對(duì)發(fā)酵乳桿菌CECT5716黏附HT-29細(xì)胞的影響

2.5.1 生長(zhǎng)階段對(duì)黏附能力的影響 分別取培養(yǎng)時(shí)間為16 h(對(duì)數(shù)期)、24 h(穩(wěn)定期)以及36 h(衰亡期)的發(fā)酵乳桿菌CECT5716菌懸液進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn),其結(jié)果如圖5。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為16 h時(shí),發(fā)酵乳桿菌CECT5716的黏附能力顯著低于培養(yǎng)時(shí)間為24 h的黏附能力(p<0.05);達(dá)到穩(wěn)定期24 h時(shí),其黏附能力達(dá)到最大,為(3.61±0.20) CFU/cell?？梢酝茰y(cè)菌體處于穩(wěn)定期階段時(shí),細(xì)胞開(kāi)始大量合成并分泌黏附素或與其相關(guān)的物質(zhì)至細(xì)胞外,而且此階段菌體細(xì)胞的表面性質(zhì)比較穩(wěn)定,從而表現(xiàn)為黏附能力顯著提高。而達(dá)到衰亡期時(shí),其黏附能力大幅度減小(p<0.05),可能是由于衰亡期的菌體形態(tài)退化造成菌體表面性質(zhì)的變化或者外界環(huán)境因子的變化破壞了黏附素的結(jié)構(gòu),從而造成黏附能力的大幅度降低。

圖5 生長(zhǎng)階段對(duì)發(fā)酵乳桿菌CECT5716黏附HT-29細(xì)胞的影響Fig.5 Effect of growth stages on the adherence of Lactobacillus fermentum CECT5716 on HT-29 cells

2.5.2 菌體濃度對(duì)黏附能力的影響 由圖6可知,當(dāng)黏附實(shí)驗(yàn)所使用的發(fā)酵乳桿菌CECT5716菌體濃度低于108CFU/mL時(shí),黏附能力隨菌體濃度的增大而顯著增加(p<0.05);當(dāng)菌體濃度達(dá)到1×109CFU/mL時(shí),與菌體濃度108CFU/mL相比，黏附能力的增加不再顯著(p>0.05),黏附達(dá)到飽和狀態(tài)?？赡苁怯捎谒拗骷?xì)胞表面特異性結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量是有限的,當(dāng)菌體濃度達(dá)到一定數(shù)量后,這些結(jié)合位點(diǎn)大部分已經(jīng)與細(xì)菌表面的黏附素發(fā)生特異性結(jié)合,所以即使再加大菌體濃度,黏附能力不再顯著增加。

圖6 菌體濃度對(duì)發(fā)酵乳桿菌CECT5716黏附HT-29細(xì)胞的影響Fig.6 Effects of cell concentration on the adherence of Lactobacillus fermentum CECT5716 to HT-29 cells

2.5.3 共孵育時(shí)間對(duì)黏附能力的影響 將制備好的發(fā)酵乳桿菌CECT5716菌懸液(108CFU/mL)與HT-29細(xì)胞分別共孵育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后,梯度稀釋平板計(jì)數(shù)黏附能力,其結(jié)果見(jiàn)圖7。發(fā)酵乳桿菌CECT5716與HT-29細(xì)胞共孵育時(shí)間小于2 h時(shí),黏附能力隨共孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加(p<0.05),當(dāng)孵育時(shí)間超過(guò)2 h后,其黏附能力不再顯著增加(p>0.05)?？梢酝茰y(cè)出發(fā)酵乳桿菌CECT5716對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附過(guò)程達(dá)到飽和存在時(shí)間上的依賴關(guān)系,即隨著共孵育時(shí)間的延長(zhǎng),HT-29細(xì)胞表面特異性受體與黏附素的結(jié)合已經(jīng)達(dá)到飽和,故黏附能力在共孵育2 h后不再增加。

圖7 共孵育時(shí)間對(duì)發(fā)酵乳桿菌CECT5716黏附HT-29細(xì)胞的影響Fig.7 Effects of incubation time on the adhesion of Lactobacillus fermentum CECT5716 to HT-29 cells

2.6 益生菌表面性質(zhì)與黏附能力間的關(guān)系

益生菌自凝集率、疏水率及黏附能力間的關(guān)系如圖8所示,它們之間的變化并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的規(guī)律性;統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果(表2)也證明它們無(wú)顯著的相關(guān)性。益生菌的黏附性與表面性質(zhì)之間的關(guān)系,一直是一個(gè)具有爭(zhēng)議性的話題。一些研究人員[9,17,22]認(rèn)為益生菌的黏附性與其表面性質(zhì)(特別是表面疏水性)成正相關(guān),但同時(shí)也有研究結(jié)果顯示它們之間并不存任何的相關(guān)性[24,30-31]。益生菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附是一個(gè)由多種因素介導(dǎo)的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞間的相互作用過(guò)程。益生菌的疏水性和自凝集是其相關(guān)表面蛋白、糖類及其他化合物所賦予的一種物理化學(xué)特性。這種特性能使益生菌更容易趨近于宿主細(xì)胞，從而完成黏附過(guò)程的第一步;此外,這些化合物可能是黏附素的組成成分,從而使益生菌有更大的概率與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合,所以益生菌具有的優(yōu)良表面性能可能有助于其對(duì)宿主細(xì)胞的黏附。

圖8 益生菌的自凝集、疏水性及黏附能力的比較分析Fig.8 Comparative analysis of auto-aggregation, hydrophobicity and adhesion of probiotics

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)六株人源益生菌的黏附性和表面性質(zhì)的考察,發(fā)現(xiàn)乳雙歧桿菌AD011的綜合性能較好,其對(duì)Caco-2和HT-29細(xì)胞的黏附性分別為(42.80±0.68)、(47.01±0.20) CFU/cell,疏水性和24 h時(shí)的自凝集率分別為81.18%和55.43%。此外,益生菌對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附性隨菌體濃度的增大而顯著增加,當(dāng)菌體濃度達(dá)到108CFU/mL時(shí),黏附能力的增加不再顯著;處于穩(wěn)定期生長(zhǎng)階段的菌體黏附能力最強(qiáng);隨著共孵育時(shí)間延長(zhǎng)至2.0 h,黏附能力隨之達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),黏附過(guò)程存在時(shí)間依賴關(guān)系。益生菌的黏附性、疏水性及自凝集作用均存在菌種特異性;此外,同一益生菌對(duì)不同結(jié)腸癌細(xì)胞表現(xiàn)出黏附性的差異,說(shuō)明益生菌的黏附作用也存在宿主的特異性;益生菌自凝集率、疏水率及黏附能力間無(wú)顯著相關(guān)性。

實(shí)驗(yàn)證明六株人源益生菌的表面性質(zhì)與黏附性能之間無(wú)顯著相關(guān),在評(píng)價(jià)益生菌的黏附性或篩選高黏附性益生菌時(shí)需要進(jìn)行各項(xiàng)黏附指標(biāo)綜合的考量。此外,乳雙歧桿菌AD011在各方面都表現(xiàn)出較好的性能,具備在人體腸道良好的潛在定植能力,在食品、藥品和保健品等行業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景。