文/張洪元 陶文兵 楊薇

優(yōu)化適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉的檢測(cè)方法 // 由于水解蛋白的水溶性，給多個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目帶來了挑戰(zhàn)，如樣品前處理沉淀不完全、難以過濾、濾液混濁、色譜圖中出現(xiàn)干擾峰，等等。本文分析了水解蛋白的特性，從樣品前處理、色譜峰識(shí)別、色譜條件（流動(dòng)相pH、濃度）、色譜柱沖洗等方面對(duì)以上項(xiàng)目檢測(cè)方法的優(yōu)化，展示了一些成功的例子，提供了一些解決方案。

乳是嬰兒理想的天然食品，牛乳是嬰兒首選的乳代品。牛乳雖然營(yíng)養(yǎng)豐富，但它與母乳相比在蛋白組成上酪蛋白含量偏高，母乳中乳清蛋白含量為60%，酪蛋白含量為40%，而牛奶中酪蛋白含量占80%，乳清蛋白含量?jī)H為20%。此外，其他營(yíng)養(yǎng)成分如β乳球蛋白、β酪蛋白等含量存在差異。正是由于這些差異，導(dǎo)致了部分嬰兒對(duì)配方乳粉的過敏反應(yīng)。已有研究表明，高溫高壓、酶水解、糖基化反應(yīng)等均能降低牛乳的過敏性，而適度水解蛋白是降低嬰兒配方乳粉致敏性的最有效可行的方法，被推薦作為嬰幼兒過敏預(yù)防的早期膳食干預(yù)方法。所以，水解蛋白配方乳粉已成為一種趨勢(shì)。

目前，市面上已有不少水解蛋白配方乳粉出現(xiàn)，此類配方乳粉的檢測(cè)需求也越來越大。由于適度水解蛋白為較小片段的蛋白或小分子多肽，與未酶解的大分子蛋白相比，其具有更好的水溶性。采用國標(biāo)方法檢測(cè)適度水解蛋白乳粉時(shí)，部分檢測(cè)項(xiàng)目（主要是水溶性維生素）遇到了挑戰(zhàn)，如樣品沉淀蛋白后難以過濾，色譜圖中出現(xiàn)干擾峰，等等。查詢國內(nèi)外文獻(xiàn)，本文特針對(duì)這些問題，提出了一些解決方案。

樣品前處理的優(yōu)化

使用沉淀劑沉淀配方乳粉中的蛋白，并過濾除去（或離心分離），是分析水溶性維生素或其余水溶性組分時(shí)除去蛋白干擾的主要方法。目前現(xiàn)行有效的國標(biāo)方法中，測(cè)試項(xiàng)目維生素C、左旋肉堿、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、?；撬?、膽堿、亞硝酸鹽與硝酸鹽、三聚氰胺均采用了此法。

但是，由于適度水解蛋白的存在，處理適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉樣品時(shí)，往往會(huì)出現(xiàn)沉淀不完全的現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為沉淀稀松，成膠體狀，在過濾樣品溶液時(shí)，堵塞濾紙，過濾速度慢，濾液不澄清，有白色渾濁。

使用玻璃纖維濾紙（如Whatman 934 AH），可有效解決這個(gè)難題。玻璃纖維濾紙各向同性好、孔徑分布均勻，具有流速高，納污能力強(qiáng)的特點(diǎn)，并可以過濾細(xì)小的顆粒。與其他的纖維材料和人工合成材料相比，玻璃纖維濾紙過濾效率更高，納污能力更強(qiáng)。使用玻璃纖維濾紙后，可有效防止濾紙堵塞，維持較快的過濾速度，同時(shí)保持濾液澄清，避免干擾后續(xù)分析操作。

色譜峰識(shí)別的優(yōu)化

圖1 優(yōu)化前?；撬嶙V圖。

圖2 優(yōu)化后?；撬嶙V圖。

圖3 優(yōu)化前硝酸鹽譜圖。

圖4 優(yōu)化后硝酸鹽譜圖。

測(cè)定分析適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉樣品時(shí)，由于適度水解蛋白的水溶性，在沉淀蛋白步驟中未被完全除去，殘存的水解蛋白會(huì)與分析物一同注入色譜體系中進(jìn)行檢測(cè)分析，并作為雜峰被檢出。部分雜峰的保留時(shí)間接近分析物，會(huì)影響分析物的保留行為，導(dǎo)致分析物主峰漂移，干擾分析物的定性，造成結(jié)果誤判。因此，需要采取措施對(duì)色譜峰識(shí)別進(jìn)行優(yōu)化，確保定性的準(zhǔn)確性。

加標(biāo)定性

加標(biāo)定性是一個(gè)簡(jiǎn)單易行的解決方案。在測(cè)試樣品中加入相同水平的標(biāo)準(zhǔn)分析物，進(jìn)樣分析，比較加標(biāo)前后分析物的峰面積變化比率是否與加標(biāo)量相符，以此確保色譜峰識(shí)別的正確性。

峰純度檢測(cè)

檢測(cè)過程中，有時(shí)雜峰與分析物保留時(shí)間完全重合，其表象為：色譜峰形正常，但加標(biāo)后峰面積未同比增加，測(cè)試結(jié)果顯著高于理論值。遇到此類情形，需考慮是否有某一雜質(zhì)與分析物同時(shí)出峰。

此時(shí)，可采用峰純度檢測(cè)。使用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）全波長(zhǎng)掃描色譜峰，如峰純度低于閾值（一般可選0.990），則該峰為混合峰，需要優(yōu)化色譜分析條件以實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步分離，確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

色譜峰分離的優(yōu)化

測(cè)定分析適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉樣品時(shí)，一些雜峰與分析物保留時(shí)間相近，未實(shí)現(xiàn)基線分離，影響了分析物的定量，如維生素B6、?；撬?、硝酸鹽。此時(shí)，便需要優(yōu)化色譜分析條件，提高定量準(zhǔn)確度。

流動(dòng)相pH優(yōu)化

水溶性維生素多采用離子對(duì)試劑實(shí)現(xiàn)色譜分離，故流動(dòng)相的pH將極大的影響分析物在色譜柱上的保留能力，影響出峰時(shí)間。

圖5 優(yōu)化前煙酰胺譜圖。

圖6 優(yōu)化后煙酰胺譜圖。

利用分析物與干擾物電離能力的微小差異，通過調(diào)整流動(dòng)相的pH，可改變分析物與干擾物的相對(duì)保留時(shí)間，實(shí)現(xiàn)基線分離，提高定量的準(zhǔn)確度。

如使用國標(biāo)GB5009.169—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中牛磺酸的測(cè)定》第二法丹磺酰氯柱前衍生法分析測(cè)定適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉中的?；撬帷Ｎ醋髡{(diào)整前，分析物有雜峰干擾，主峰無分離度，基線也有漂移，強(qiáng)制垂直切分，無法確保結(jié)果的準(zhǔn)確度，如圖1所示。

只調(diào)整流動(dòng)相pH，由4.2降為4.1，雜峰保留時(shí)間延長(zhǎng)，與分析物牛磺酸實(shí)現(xiàn)了基線分離，基線也相對(duì)平緩，分離度為2.11，定量結(jié)果準(zhǔn)確度改善，如圖2所示。

流動(dòng)相濃度優(yōu)化

離子色譜法是利用被測(cè)物質(zhì)的離子性進(jìn)行分離和檢測(cè)的液相色譜法。離子色譜淋洗液的濃度是影響分析物保留時(shí)間的重要因素。調(diào)整淋洗液濃度，將實(shí)現(xiàn)反相液相色譜中調(diào)整有機(jī)相比例同樣的效果，改變分析物與干擾物的相對(duì)保留時(shí)間，實(shí)現(xiàn)分離的目的。

如國標(biāo)GB5009.33—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》第一法離子色譜法測(cè)定適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉中的硝酸鹽。優(yōu)化前，分析物與雜峰未基線分離，強(qiáng)制垂直切分后定量結(jié)果不準(zhǔn)確，如圖3所示。

調(diào)整淋洗液濃度，由5 mmol/L 13 min, 11 mmol/L 9 min, 50 mmol/L 5 min, 5 mmol/L 7 min改為5 mmol/L 13 min, 9 mmol/L 9 min, 50 mmol/L 5 min, 5 mmol/L 7 min，降低了中間KOH淋洗液濃度，雜峰保留時(shí)間延后，與主峰硝酸鹽實(shí)現(xiàn)了基線分離，分離度達(dá)到了1.83，提高了定量準(zhǔn)確度，如圖4所示。

色譜柱沖洗

由于適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，在進(jìn)行色譜分析時(shí)，分析物主峰之后可能還有大量的雜質(zhì)峰。它們的保留能力各不相同，有些雜峰可能具有極強(qiáng)的保留能力，如果色譜運(yùn)行時(shí)間沒有足夠長(zhǎng)，其可能在下一針中出峰，影響樣品定量。因此，需確保色譜運(yùn)行足夠時(shí)間，或提高有機(jī)相濃度，保證高保留物質(zhì)的洗脫。

如國標(biāo)GB 5009.89-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中煙酸和煙酰胺的測(cè)定》第二法高效液相色譜法測(cè)定適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉中的煙酸和煙酰胺，未優(yōu)化前，前一針樣品的高保留物質(zhì)與下一針樣品中的煙酰胺一同出峰，嚴(yán)重干擾了定量的準(zhǔn)確性，如圖5所示。

在分析物主峰出峰后，增大有機(jī)相甲醇比例，同時(shí)延長(zhǎng)色譜運(yùn)行時(shí)間，沖洗出雜質(zhì)峰，再恢復(fù)初始流動(dòng)相并平衡，解決了雜峰干擾，如圖6所示。

結(jié)論

本文分析了適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉樣品測(cè)試分析時(shí)遇到的困難和挑戰(zhàn)，并依據(jù)不同問題提供了解決方案和思路，重點(diǎn)介紹了液相色譜分析時(shí)通過小幅調(diào)整流動(dòng)相pH、濃度等，優(yōu)化分析測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性。 ■