新布任 王濤 馬燕妮 宋涵 王明明

摘? 要：選取禾本科植物高羊茅的葉片，采用低溫?fù)v碎分級分離方法，分離出天然硅體，進一步分離硅體和硅質(zhì)化細(xì)胞壁，去除硅質(zhì)化細(xì)胞壁組分中的雜質(zhì)蛋白，并利用硅體的專一性染色法進行驗證后，再進一步提取出粗的硅結(jié)合蛋白，通過SDS-PAGE鑒定出大小為117kDa的硅結(jié)合蛋白，最終通過切膠回收透析的方法獲取純凈的硅結(jié)合蛋白，得出了一套有效的硅體分離提取的方法。該研究首次從高羊茅葉片中分離提取硅體，為高羊茅的抗逆性研究及快速生長研究提供了蛋白獲取基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：硅結(jié)合蛋白;高羊茅;低溫?fù)v碎分級分離法;SDS-PAGE

中圖分類號 S143? ?文獻標(biāo)識碼 A? ?文章編號 1007-7731（2019）09-0011-3

硅在自然界中分布廣泛，巖石、水流及動植物體內(nèi)等均有其存在，主要以二氧化硅和硅酸鹽等形式存在，陸地生物系統(tǒng)和海洋生物系統(tǒng)大部分都存在硅的生物循環(huán)[1]。研究表明，硅是在植物生長的過程中，即使過量也不會對其產(chǎn)生危害作用的有益元素。如今硅肥已經(jīng)是世界各地普遍使用的無任何毒副作用的新型肥料，是具有增產(chǎn)和抗逆的作用的天然農(nóng)藥[2]，硅的主動吸收機制在很多植物內(nèi)都存在[3]，參與生物體很多的新陳代謝過程，其在動物以及單細(xì)胞生物（如硅藻）中的必需性已有研究證明[4]。硅對于植物生長有益，硅元素的缺乏會導(dǎo)致非典型環(huán)境脅迫[5]。

硅以硅結(jié)合蛋白的形式存在于植物體，史新慧等研究表明，禾本科植物中含有大量的硅結(jié)合蛋白，并分離出水稻SBP117硅結(jié)合蛋白[6]。硅結(jié)合蛋白可以提高植物的光合作用和根系活性，增強植物的抗倒伏性、抗病能力、抗逆能力[7-9]，降低植物的蒸騰作用，提高產(chǎn)量和品質(zhì)，促進養(yǎng)分的吸收。細(xì)胞壁、硅化細(xì)胞和胞間隙或角質(zhì)層是硅在植物體內(nèi)的主要沉積位置[10]。Yoshida等[11]研究表明，在水稻葉片中，硅元素含量最高的部位是葉尖，硅元素主要的沉積部位為葉片的上下表皮、維管束鞘以及相連的厚壁細(xì)胞。

高羊茅（Festuycaelata）屬禾本科、羊茅屬多年生草本植物，因其耐熱，耐踐踏，草坪成型快，顏色濃綠，抗逆性強，管理方便以及成本低等優(yōu)點，一直是足球場、高爾夫場、公園等的綠化優(yōu)選草種。劉慧霞等[12]研究表明，在高鹽環(huán)境下，硅能提高高羊茅的適應(yīng)能力[13]。宋銳研究表明，在高鹽的脅迫下，硅通過直接參與高羊茅的生理生化過程，提高了其在高鹽環(huán)境下幼苗的適應(yīng)能力[14]。本研究利用低溫?fù)v碎提取法對在高鹽環(huán)境中生存的高羊茅進行了硅結(jié)合蛋白的提取并鑒定，為高羊茅的抗逆性及快速生長研究提供蛋白獲取基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 大小適中、均勻一致的高羊茅種子。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子發(fā)芽試驗 將購買的高羊茅種子裝入紙袋放置暗處室溫下貯藏。開始實驗時，選擇成熟、飽滿、大小適中且一致的種子，先進行消毒，用蒸餾水反復(fù)沖洗，將種子表面水分用濾紙吸干后，整齊地放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿放50粒種子，選擇不同濃度外源硅離子（硅酸鉀+氯化鉀）來培育。外源硅離子的濃度分別為：2mmol/L的硅酸鉀溶液（K2SiO3）和4mmol/L的氯化鉀溶液（KCl）的Si+組，以及加入4mmol/L的硅酸鉀溶液（K2SiO3）和8mmol/L的氯化鉀溶液（KCl）的Si++組。當(dāng)K2SiO3溶于水后，加入的Cl-后會阻止弱酸根離子生成H2SiO3，使得實驗所需Si2+誤差變小。KCL中的K+是植物生長的營養(yǎng)元素，文獻報道低濃度的Cl-個對植物基本上沒有影響。每組進行3個重復(fù)實驗組，放在光照培養(yǎng)箱內(nèi)（20℃，16/8h，15000l）培養(yǎng)，至種子萌發(fā)長出四葉后備用。

1.2.2 天然硅體的分離 采用低溫?fù)v碎分級分離法從發(fā)芽好的高羊茅中分離天然硅體，具體步驟如下：

1.2.2.1 分離出硅體和硅質(zhì)化細(xì)胞壁 取高羊茅葉片剪碎，放于-20℃冰箱，冷凍過夜后取出放于室溫，融化后與1%TrionX-100按照體積比1∶3進行混合，之后用JJ-2型組織搗碎勻漿機搗碎、1mm篩網(wǎng)過濾，得到濾液。靜置，自然沉降3min直至沉降物不再增多，棄掉上清。用0.1%SDS溶液重懸沉降物，靜置棄上清，反復(fù)至上清液透明為止，去除大部分非硅質(zhì)化細(xì)胞壁碎片及細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)，獲得粗制硅體及硅質(zhì)化細(xì)胞壁。

1.2.2.2 去除硅質(zhì)化細(xì)胞壁組分中的雜質(zhì)蛋白 將以上得到淺綠色沉降物，參照史新慧[15]的方法，將沉降物與2%SDS漂洗液按照體積比1∶4進行混合，放于90℃1h，期間間歇式混勻后水洗，重復(fù)以上操作。最后將上清棄掉，保留沉降物，再用丙酮進行漂洗，將沉降物與丙酮按照體積比1∶2進行混合在室溫下攪拌直至無黃色物質(zhì)析出。最后用高鹽溶液漂洗，將沉降物與6mol/LNaCl按照體積比1∶4進行混合，室溫下攪拌30min后，棄上清并水洗，留沉降物。

1.2.2.3 獲得純粹的硅體 將以上得到的沉降物用40um的篩網(wǎng)過濾，除去大的硅質(zhì)化細(xì)胞壁碎片，獲得純粹的硅體。

1.2.3 硅體的專一性染色法 參照Dyanaakan等[16]的染色方法，依次進行脫色、酸處理、脫水、染色，最后在光學(xué)顯微鏡下進行觀察硅體形態(tài)。

1.2.4 提取硅結(jié)合蛋白 參照Harrison[17]的方法，先用NH4F進行處理，按每1g濕硅質(zhì)化細(xì)胞壁加入4mL 10mol/LNH4F在數(shù)顯恒溫磁力攪拌器攪拌，直至在顯微鏡觀察硅體溶解完全，再用HF處理將收集的細(xì)胞壁與8%HF溶液同體積混合，攪拌3h，收集濾液，將濾液進行透析，使用冷凍干燥處理濃縮，收集干燥物即為硅結(jié)合蛋白。

1.2.5 通過SDS-PAGE電泳鑒定硅結(jié)合蛋白的大小 參照Hermannn和Gebhard[18]的方法進行跑電泳，跑完電泳后將凝膠浸泡于考馬斯亮藍(lán)染色液中緩慢搖動30～60min進行染色處理，最后將凝膠浸泡于洗脫液中緩慢搖動1～2h，其間更換洗脫液1～2次，洗脫后凝膠照像。

1.2.6 純化硅結(jié)合蛋白 根據(jù)Mashairo S等[19]的方法，用透析袋電洗脫法洗脫純化目的蛋白，將所需目的條帶從SDS-PAGE凝膠切下，放入透析袋后進行電泳回收，將透析袋放進盛有預(yù)冷的Tris甘氨酸電泳緩沖液直至考馬斯亮藍(lán)完全從凝膠條帶上跑出，再進行4℃透析，最后用冷丙酮沉淀法處理透析袋內(nèi)的液體進行蛋白沉淀。采用Brandford法，測定純化的蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硅離子濃度對高羊茅種子發(fā)芽生長的影響 本次研究表明，Si+組比Si++組高羊茅葉片長勢不同，Si+組高羊茅葉片豐富，生長密度高，平均長度為7～8cm，同一周期內(nèi)生長比較快，而Si++組高羊茅葉片比較稀疏，生長密度較Si+組低，平均長度為6～7cm，同一周期內(nèi)生長比較緩慢。

2.2 不同硅離子濃度對細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的影響 如圖1所示，a箭頭所指為在光學(xué)顯微鏡下油鏡（10×100倍鏡）觀察到Si+組的硅細(xì)胞，硅細(xì)胞形態(tài)短而粗，在葉表皮細(xì)胞之間的夾縫產(chǎn)生，不同視野硅細(xì)胞數(shù)量較少。b箭頭所指為在光學(xué)顯微鏡下油鏡（10×100倍鏡）觀察到Si++組的硅細(xì)胞，硅細(xì)胞形態(tài)長而細(xì)，在葉表皮細(xì)胞之間的夾縫產(chǎn)生，不同視野硅細(xì)胞數(shù)量較多。

2.3 硅結(jié)合蛋白分子的大小 由圖2可知：泳道1：Marker：泳道2～4：從加入了2mmol/L硅酸鉀溶液（K2SiO3）和4mmol/L氯化鉀溶液（KCl）的Si+組發(fā)芽的高羊茅提取的硅結(jié)合蛋白，泳道5～7：從加入了4mmol/L硅酸鉀溶液（K2SiO3）和8mmol/L氯化鉀溶液（KCl）的Si++組發(fā)芽的高羊茅提取的硅結(jié)合蛋白。通過SDS-PAGE鑒定，硅結(jié)合蛋白的大小為117kDa。

3 討論

提取的硅體在顯微鏡下觀察，Si++組較Si+組的的硅細(xì)胞形態(tài)長而細(xì)，不同視野硅細(xì)胞數(shù)量較多，且從SDS-PAGE電泳的結(jié)果圖來看，Si++組的高羊茅提取的硅結(jié)合蛋白含量較高，并鑒定出了硅結(jié)合蛋白的大小。硅促進植物生長主要通過3種方式，即影響葉片光合作用、減少倒伏和增強根系活性等。在維管組織和表皮細(xì)胞中硅的沉積增強組織的機械性能，從而增大了葉片受光面積、提升了群體光合效率。硅細(xì)胞長而細(xì)的形態(tài)可能更有利于植物進行光合作用，增強抗逆性。在植物體內(nèi)硅元素主要存在于細(xì)胞壁、硅化細(xì)胞和胞間隙或角質(zhì)層。在高羊茅草的葉鞘中，硅體主要存在于硅化細(xì)胞、泡狀細(xì)胞、硅質(zhì)化表皮細(xì)胞以及硅質(zhì)化表皮毛等。大部分硅質(zhì)化表皮細(xì)胞形態(tài)為長形。

植物體中，硅的存在形態(tài)為水化無定形二氧化硅（SiO2·nH20）、二氧化硅（SiO2）、硅酸和膠狀硅酸，其中水化無定形二氧化硅（SiO2·nH20）、二氧化硅（SiO2）為主要存在形態(tài)[21]。不同植物對硅的吸收能力不同，與植物本身的基因型和環(huán)境有關(guān)，在pH小于9的條件下，硅以單硅酸Si（OH）4的形式被植物吸收。目前認(rèn)為高等植物由于硅與不同植物種類的關(guān)系不同，硅的吸收形式有主動吸收、被動吸收和拒絕吸收3種[22]。硅對于高羊茅的抗逆性及生長促進作用機制有待今后作進一步的研究。

參考文獻

[1]劉鳴達(dá)，張玉龍，陳溫福.土壤供硅能力評價方法研究的歷史回顧與展望[J].土壤，2006（1）：11-16.

[2]MaJ.F.，Y.Miyake，E.Takahashi.Silicon as a beneficial element for crop plants.In：Datonoff L.，G Korndoref，G.Synder，eds.Silicon in Agriculutre[J].New York：Elsevier Science，2001：17-39.

[3]TamaiK.，J.F.Ma.CharaeteriZation of silicon uptake by rice roots[J].New Phytol.，2003，158：431-436

[4]wernerD.，R.Roth.Silica metabolism[J].In：Inorganic Plnat Nutrition.New York：New Series，1983.

[5]EPsteinE.The anomaly silicon in Plant biology[J].Proc，Natl.Acad.Sci.USA，1994，91：11-17.

[6]史新慧，覃闖登，宋建蘭.水稻及其他禾本科植物體內(nèi)硅結(jié)合蛋白的免疫印跡檢測[J].生物化學(xué)與生物物理進展，2005，32（4）：371-376.

[7]EPsteinE.Silicon.Annu.Rev.Plant Physiol[J].Plant Mol. Biol.，1999，

50：641-664.

[8]NeumnanD.，U.Zurnieden.Silicon and heavy metal tolernace of higher Plnats[J].Phytochemistry，2001，56：685-692.

[9]Linag.YC.，J.W.C.Wong，L.Wei.Silicon-mediated enhancement of cadmium tolerance in maize（ZeamyasL.）grown in cadmium contmainated soil[J].Chemosphere，2005，58（4）：475-484.

[10]李文彬.水稻體內(nèi)硅的生理功能及沉積機理的研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[11]Yoshida S.，Y.Ohnishi，K.Kigatishi.Histochmseltry of silicon in rice Plant.II.Localization of silicon within rice tissues[J].Soil Sci.Plant Nutr.，1962，8（l）：36-41.