，

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

2012-10-16

武羿君(1988—)，女，內(nèi)蒙古呼和浩特人。*通訊作者，Email：huxu0309@yahoo.com.cn。

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(XCX1019)；中國(guó)科學(xué)院植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(Y052811t04)；湖南省教育廳項(xiàng)目(KC2011B023)。

2，4-D和6-BA對(duì)高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)的影響

武羿君，徐慶國(guó)*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

以高羊茅成熟種子為外植體，采用MS 基本培養(yǎng)基，研究了不同濃度的2,4-D和6-BA對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：不同濃度2,4-D對(duì)高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)率差異顯著，以9 mg/ L效果最好，濃度過高，愈傷組織誘導(dǎo)率下降；在0～0.8 mg/ L范圍內(nèi)，高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)率隨6-BA 濃度的增加而增大，當(dāng)濃度為0.6 mg/L時(shí)誘導(dǎo)效果最好。

高羊茅；組織培養(yǎng)；愈傷組織；2,4-二氯苯氧乙酸；6-芐氨基嘌呤

高羊茅又稱葦狀羊茅，禾本科羊茅屬，原產(chǎn)歐洲西部，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是溫帶地區(qū)建立人工草地和補(bǔ)播天然草場(chǎng)的重要草種[1]。高羊茅屬多年生冷季型草種，具有抗干旱、耐瘠薄、抗病性強(qiáng)、耐粗放管理、適應(yīng)性廣及綠期長(zhǎng)、觀賞性高等特點(diǎn)，因此，廣泛應(yīng)用于世界各國(guó)的綠地建設(shè)和水土保持等各類草坪中[2]。高羊茅作為一種重要草種，不僅廣泛應(yīng)用于內(nèi)蒙古、新疆、甘肅、黑龍江等我國(guó)北方省市的牧場(chǎng)草地和綠化草坪建植中，在我國(guó)南方草坪過渡性地帶的常綠草坪建植中也發(fā)揮著重大作用，是我國(guó)目前較為常用的冷季型草坪草種之一[3～5]。

國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)草坪草育種的研究歷史較長(zhǎng)，早已開展了對(duì)高羊茅的轉(zhuǎn)基因研究，并獲得了轉(zhuǎn)基因工程植株，實(shí)現(xiàn)了對(duì)高羊茅性狀的定向改良[6]。國(guó)內(nèi)對(duì)草坪草植株再生體系的研究開展較晚，直到20世紀(jì)90年代隨著草坪業(yè)的快速發(fā)展才得以起步研究。與其他重要的禾本科作物相比，國(guó)內(nèi)關(guān)于高羊茅的組織培養(yǎng)研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后，而成功建立高羊茅再生植株的報(bào)道更為少見[7]。國(guó)內(nèi)雖然也對(duì)高羊茅的組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因進(jìn)行了一些研究，但其研究深度和廣度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。一般認(rèn)為愈傷組織是轉(zhuǎn)基因的理想受體，要對(duì)草坪草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，首先要建立其愈傷組織再生體系，而愈傷組織的誘導(dǎo)是建立再生體系的前提和基礎(chǔ)[8～10]。國(guó)內(nèi)對(duì)高羊茅愈傷組織的誘導(dǎo)曾有不少研究，認(rèn)為不同濃度的2,4-D和6-BA對(duì)高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)有重要影響，對(duì)高羊茅再生體系的建立和轉(zhuǎn)基因育種具有十分重要的意義。本研究選取不同品種高羊茅成熟種子為外植體，研究不同濃度的2，4-D和6-BA對(duì)高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)的影響，試圖找到能產(chǎn)生高羊茅愈傷組織高出愈率的2,4-D和6-BA最佳濃度，建立適宜的高羊茅再生體系，為高羊茅的轉(zhuǎn)基因育種建立基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試高羊茅品種

北京百綠(天津)國(guó)際草業(yè)有限公提供的3個(gè)高羊茅(Festucaarundinacea)品種：交戰(zhàn)Ⅱ(Crossfire Ⅱ)、貝克(Baker)、獵狗(Hound)。

1.2 外植體處理方法

分別取各供試高羊茅品種成熟種子，在50 %的硫酸中浸泡30 min，脫去穎殼后用清水洗凈，去掉雜質(zhì)，再用清水浸泡12 h，清水沖洗后置于4℃環(huán)境下備用。

1.3 試驗(yàn)方法

按MS配方配置MS培養(yǎng)基作為本研究的基本培養(yǎng)基。在MS基本培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的6-BA和2,4-D，各種處理培養(yǎng)基pH值均調(diào)至5.8，分別設(shè)置如下2種不同激素濃度的單因素試驗(yàn)。

(1)在MS培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的2,4-D，作為高羊茅愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。2,4-D 濃度分別為0、3、6、9和12 mg/L，以未加2,4-D的MS培養(yǎng)基為對(duì)照。每種處理分別接種30粒不同高羊茅品種種子，每個(gè)培養(yǎng)基組合設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共計(jì)5組，每組9個(gè)處理。

(2)在MS培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的6-BA，作為3個(gè)高羊茅品種愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。6-BA濃度分別為0、0.2、0.4、0.6和0.8 mg/L，以未加6-BA的MS培養(yǎng)基為對(duì)照。每種處理分別接種30粒不同高羊茅品種種子，每個(gè)培養(yǎng)基組合設(shè)置3個(gè)重復(fù)，共計(jì)5組，每組9個(gè)處理。

1.4 接種

在超凈工作臺(tái)上，將已經(jīng)過處理的高羊茅種子分別用70%的酒精消毒30～40 s， 用無(wú)菌水沖洗3～5次，再用0.1%升汞(氯化汞)溶液處理3～4 min后用無(wú)菌水沖洗4～5次。將經(jīng)過消毒處理的3個(gè)不同高羊茅品種的種子接種到不同培養(yǎng)基組合，置于25～26℃，暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.5 愈傷組織觀察及記錄

不同品種的高羊茅種子接種7 d后開始統(tǒng)計(jì)不同處理組合的發(fā)芽率、出愈率，每隔5 d統(tǒng)計(jì)1次。按如下公式統(tǒng)計(jì)各處理的發(fā)芽率、出愈率：

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/接種數(shù)×100

出愈率(%)=不再變化后愈傷數(shù)/接種數(shù)×100

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本研究所有統(tǒng)計(jì)分析工作采用Excel統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同2,4-D濃度對(duì)高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表1可知，不同濃度的2,4-D對(duì)高羊茅的發(fā)芽率影響不顯著，且高羊茅的發(fā)芽率對(duì)其愈傷組織的出愈率影響也不明顯。最終發(fā)芽率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，不同高羊茅品種的發(fā)芽率與2,4-D的濃度不存在顯著相關(guān)，與其出愈率的相關(guān)也未達(dá)顯著水平。

不同2,4-D濃度培養(yǎng)基接種的高羊茅種子在暗培養(yǎng)7 d后，大部分種子在芽鞘和種子連接處產(chǎn)生了白色水浸狀、柔軟松散的物質(zhì)；在連續(xù)培養(yǎng)20 d后，愈傷組織的顏色由白色透明轉(zhuǎn)變?yōu)榘胪该鞯S色。40 d后統(tǒng)計(jì)不同處理的愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果，表明不同濃度的2,4-D對(duì)高羊茅愈傷組織的誘導(dǎo)率影響不同。在5種2,4-D處理濃度中，處理濃度為9 mg/L的出愈率為43%，極顯著高于其他處理濃度的出愈率；2,4-D濃度為6 mg/L的出愈率極顯著高于濃度為3 mg/L和12 mg/L的出愈率(表1)。由此可知，在一定的濃度范圍內(nèi)，2,4-D能夠提高高羊茅愈傷組織的出愈率，但濃度過高反而會(huì)降低高羊茅愈傷組織的出愈率，其中以添加2,4-D 9 mg/L的MS培養(yǎng)基對(duì)高羊茅成熟種子的愈傷組織誘導(dǎo)效果最好。

表1 不同2，4-D濃度處理的高羊茅種子發(fā)芽率與出愈率

注：表中同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示α= 0. 05 水平上差異顯著，不同大寫字母表示α= 0. 01 水平上差異極顯著。下同。

2.2 不同6-BA濃度對(duì)高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)的影響

經(jīng)過消毒處理的高羊茅種子在配有不同濃度6-BA的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7 d后，開始發(fā)芽。由表2可以看出，不同濃度的6-BA對(duì)高羊茅的發(fā)芽率影響不明顯，并且高羊茅的發(fā)芽率對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)的影響差異也未達(dá)顯著水平。最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，高羊茅的發(fā)芽率與6-BA的濃度和出愈率均未達(dá)顯著水平的相關(guān)。

不同6-BA濃度培養(yǎng)基接種的高羊茅外植體暗培養(yǎng)7 d后，大部分高羊茅種子在芽鞘和種子連接處產(chǎn)生了白色水浸狀、柔軟松散的物質(zhì)；20 d后開始出現(xiàn)淡黃色的愈傷組織。40 d后統(tǒng)計(jì)不同處理的愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果，不同濃度的6-BA處理，其高羊茅愈傷組織的誘導(dǎo)率不同。在5種6-BA處理濃度中，濃度0.8 mg/L的出愈率為23.3%，極顯著高于其他處理濃度的出愈率；濃度為0.6 mg/L的出愈率極顯著高于濃度為0.2 mg/L和0.4 mg/L的出愈率(表2)。由此說明，當(dāng)6-BA在一定范圍濃度內(nèi)，隨著6-BA濃度的增加，高羊茅愈傷組織的誘導(dǎo)率也隨之增加。

表2 不同6-BA濃度的高羊茅種子發(fā)芽率與出愈率

3.3 不同高羊茅品種對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表3和表4可知，不同高羊茅品種在不同2，4-D濃度和不同6-BA培養(yǎng)基接種后的發(fā)芽率差異均未達(dá)顯著水平。以獵狗5號(hào)的發(fā)芽率最高，但其出愈率卻不是最高的，由此表明高羊茅品種的發(fā)芽率與其出愈率不存在顯著相關(guān)，但是，不同高羊茅品種對(duì)其愈傷組織的誘導(dǎo)率存在明顯基因型差異。由表3可知，不同高羊茅品種種子在2,4-D培養(yǎng)基中的愈傷組織的誘導(dǎo)率不同，交戰(zhàn)Ⅱ的出愈率為28.4%，極顯著高于其他2個(gè)高羊茅品種；而獵狗5號(hào)和貝克的出愈率差異未達(dá)顯著水平。

表3 不同高羊茅品種在2，4-D培養(yǎng)基中的平均發(fā)芽率與出愈率

從表4可以看出，不同高羊茅品種種子在6-BA培養(yǎng)基中的愈傷組織的誘導(dǎo)率不同，獵狗5號(hào)的愈傷組織出愈率為16%，極顯著高于其他2個(gè)高羊茅品種。同一高羊茅品種種子在不同激素作用下的出愈率不同。如貝克在不同濃度2,4-D和不同濃度6-BA培養(yǎng)基接種后的發(fā)芽率幾乎沒有變化，但其平均出愈率卻相差12.5個(gè)百分點(diǎn)。

表4 不同高羊茅品種在6-BA培養(yǎng)基中的平均發(fā)芽率與出愈率

3 討論

3.1 不同2,4-D和6-BA濃度對(duì)高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)的影響

本研究采用獵狗、交戰(zhàn)Ⅱ和貝克等3個(gè)高羊茅品種的成熟種子為外植體，進(jìn)行了不同濃度2,4-D和不同濃度6-BA培養(yǎng)基的高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)研究。結(jié)果表明，植物生長(zhǎng)素2,4-D對(duì)該3個(gè)高羊茅品種愈傷組織的誘導(dǎo)有明顯的促進(jìn)作用。當(dāng)2，4-D濃度在0～9 mg/L范圍內(nèi)，隨著2,4-D濃度的增加，其愈傷組織的誘導(dǎo)率升高；但當(dāng)2,4-D濃度增高到一定程度(9 mg/L)后，其誘導(dǎo)率呈下降趨勢(shì)。郎春秀等[3]研究發(fā)現(xiàn)，2,4-D對(duì)高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)的最佳濃度為8 mg/L，而高麗美等[11]試驗(yàn)結(jié)果顯示，2,4-D誘導(dǎo)高羊茅成熟種子的最佳濃度是9 mg/L，這與本試驗(yàn)研究的結(jié)果基本吻合。

本研究表明，當(dāng)6-BA濃度在0～0.8 mg/L范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度的增加，高羊茅愈傷組織的誘導(dǎo)率也隨之有升高的趨勢(shì)；當(dāng)6-BA濃度增加到0.8 mg/L時(shí)，雖然高羊茅的愈傷組織誘導(dǎo)率升高，但其長(zhǎng)勢(shì)卻變差，愈傷組織不透明、硬實(shí)，生長(zhǎng)緩慢，最后轉(zhuǎn)變?yōu)榘迭S色，利用價(jià)值低。本研究只研究了一定濃度6-BA對(duì)不同高羊茅品種愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，今后還可以在此基礎(chǔ)上繼續(xù)研究不同濃度6-BA對(duì)高羊茅愈傷組織分化的影響，進(jìn)而獲得最佳的促進(jìn)高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)的6-BA濃度。

本研究采用了3個(gè)不同高羊茅品種的成熟種子為外植體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基上添加6～9 mg/L 2,4-D和0.4～0.6 mg/L 6-BA對(duì)高羊茅愈傷組織的誘導(dǎo)都有較大的促進(jìn)作用。而此前劉衛(wèi)東等的研究認(rèn)為，不同種類的基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)沒有顯著差異。易自力等[13]通過比較NB、MS和CC 3種植物組織培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基，認(rèn)為進(jìn)行高羊茅成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)宜采用CC培養(yǎng)基。何陽(yáng)鵬等[14]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BA對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)存在一定濃度的負(fù)效應(yīng)，在培養(yǎng)基中添加的BA濃度越高，愈傷誘導(dǎo)率越受抑制。為了進(jìn)一步提高高羊茅種子愈傷組織的誘導(dǎo)率，今后可選用多種植物生長(zhǎng)素和植物細(xì)胞分裂素濃度配比及其添加其他生物活性物質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，從而獲得最佳植物激素組合的培養(yǎng)基。

3.2 不同基因型對(duì)高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)的影響

本研究采用了湖南等我國(guó)草坪過渡帶地區(qū)常用的3個(gè)高羊茅品種進(jìn)行不同濃度的2,4-D和不同濃度6-BA培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)研究，結(jié)果表明，3個(gè)供試高羊茅品種成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)率存在一定的基因型差異。如在不同2,4-D濃度培養(yǎng)基誘導(dǎo)高羊茅愈傷組織的試驗(yàn)中，3個(gè)高羊茅品種的發(fā)芽率相似，但平均出愈率卻相差甚大，其中，交戰(zhàn)Ⅱ的平均出愈率為28.4%，極顯著高于其他2個(gè)高羊茅品種的出愈率。高羊茅組織培養(yǎng)的基因型差異在以往已有相關(guān)報(bào)道。如：Bai和Qu[15]的研究表明，在25個(gè)供試品種中，愈傷組織誘導(dǎo)率相差達(dá)數(shù)倍甚至10倍以上。郎春秀等[3]在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)2,4-D濃度為8 mg/L、ABA濃度為2 mg/L時(shí)，高羊茅可奇思的愈傷組織誘導(dǎo)率高出獵狗5號(hào)13.4個(gè)百分點(diǎn)。吳關(guān)庭等[16]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在BAP與KT配比、NAA濃度和瓊脂濃度試驗(yàn)中，各自適宜濃度條件下，高羊茅獵狗5號(hào)的總愈傷組織再生率比美洲虎3號(hào)高23.8～29.3個(gè)百分點(diǎn)。余桂紅等[5]以5個(gè)高羊茅品種成熟種子為外植體，研究表明，不同高羊茅品種成熟種子在相同培養(yǎng)基上的出芽率和出愈率差異很大。這些結(jié)果表明，在今后有關(guān)高羊茅愈傷組織培養(yǎng)的研究中，應(yīng)針對(duì)不同高羊茅品種選擇相適宜的激素濃度，以達(dá)到最佳誘導(dǎo)效果。并且在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究不同激素種類及濃度對(duì)高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)的影響，最終實(shí)現(xiàn)湖南本地高羊茅草種的抗熱性改良，實(shí)現(xiàn)高羊茅在湖南等草坪草過渡性地帶的四季常綠。

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1001-5280(2012)07-0021-04

10.3969/j.issn.1001-5280.2012.07.06