(1.衢州檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心 ， 衢州 324000；2.浙江工商大學(xué) ， 杭州 310018 ；3.溫州大學(xué) ， 溫州 325035)

1 引言

魚糜制品是指以生鮮魚或者冷凍魚為原料，加入食鹽等輔料經(jīng)擂潰、斬拌、成型、凝膠化等加工過程形成具有一定彈性的凝膠狀食品的總稱[1]，如魚腸、魚糕、模擬蟹肉等海鮮產(chǎn)品[2]。因其高蛋白、低脂肪、營養(yǎng)價(jià)值高、味道鮮美等優(yōu)點(diǎn)而深受消費(fèi)者的喜愛，進(jìn)一步提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。魚糜制品在加工時(shí)為提高其口感和凝膠強(qiáng)度，通常會(huì)加入一定量的蛋白質(zhì)作為彈性增強(qiáng)劑，主要有大豆蛋白、乳清蛋白、雞蛋清蛋白等[4]。而這些蛋白恰恰是引起食物過敏常見的食物種類。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約8%兒童和約2%成年人對(duì)食物過敏，食物過敏已成為威脅人類健康的主要問題之一[5]。避免食用含有過敏原的食物是目前唯一有效的預(yù)防辦法，為幫助易感人群遠(yuǎn)離食物過敏，歐盟、美國、澳大利亞、新西蘭等國家相繼采取食品中過敏原強(qiáng)制標(biāo)識(shí)技術(shù)貿(mào)易措施[6，7]，也對(duì)我國魚糜產(chǎn)品出口造成巨大影響，因標(biāo)簽不符合進(jìn)口國要求而被通報(bào)及退運(yùn)等往往使中國食品出口企業(yè)在過敏原這道壁壘上受挫[8]。

目前，檢測(cè)食品中大豆過敏原成分主要兩種方法：基于抗體的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[9，10]和基于DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法[11，12]。但ELISA方法靈敏度不高且存在交叉作用，容易導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果；PCR技術(shù)是基于DNA的檢測(cè)手段，而不能直接檢測(cè)致敏蛋白，故限制了它們?cè)谑澄镞^敏原中的應(yīng)用[13]?，F(xiàn)階段，有人嘗試將蛋白質(zhì)組學(xué)與液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量分析。Boo[14]等利用LC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)餅干中雞蛋、牛奶、花生中的過敏蛋白，檢出限低至5mg/kg。Planque M[15]等人利用液質(zhì)聯(lián)用方法定量多種復(fù)雜基質(zhì)中過敏原蛋白，其中大豆過敏原蛋白檢出限為5mg/kg。Na Lin[16]等利用同位素標(biāo)記的多肽作為內(nèi)標(biāo)，提高了方法的準(zhǔn)確性。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)因其高靈敏度、特異性能準(zhǔn)確的定性定量分析復(fù)雜食品基質(zhì)中的蛋白含量。蛋白的液質(zhì)檢測(cè)方法是基于對(duì)胰蛋白酶水解產(chǎn)生的肽段進(jìn)行檢測(cè)，該肽段具有特異性且能滿足定量分析目標(biāo)蛋白的要求。該方法的關(guān)鍵之處是在于篩選出目標(biāo)蛋白的一個(gè)或者更多的特征肽段。在這個(gè)策略基礎(chǔ)上，本研究合成了大豆過敏蛋白Glycinin G2的特征肽段來定性定量分析魚糜制品中大豆蛋白的含量。

目前，對(duì)于魚糜制品中大豆過敏原蛋白的液相色譜-三重四級(jí)桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜方法未見報(bào)道，本研究采用MRM-IDA-EPI采集模式，當(dāng)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)信號(hào)超過設(shè)定的閾值時(shí)，儀器會(huì)被觸發(fā)交替進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)和增強(qiáng)子離子掃描，在一次進(jìn)樣過程中既可以采集到多反應(yīng)監(jiān)測(cè)譜圖，也可以采集到增強(qiáng)子離子二級(jí)譜圖，通過譜庫檢索達(dá)到同時(shí)定性和定量的目的。

2 材料與方法

2.1 試劑

二硫蘇糖醇(DTT)、碳酸氫銨(NH4HCO3)、碘乙酰胺(IAA)(分析純)購自美國Sigma-Aldrich 公司；甲酸(FA)(HPLC級(jí))購自美國Tedia 公司；乙腈(ACN)(HPLC級(jí))購自德國Merck 公司；胰蛋白酶(測(cè)序級(jí)，比活度>8000 units/mg protein)購自美國Sigma-Aldrich 公司。Tris-HCL購置Bio-Rad公司。

鳙魚購自杭州農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；大豆分離蛋白粉來購自Bio-Rad；安井牌魚丸、安井牌魚豆腐、丸之尊魚豆腐、安井牌仿蟹柳、海霸王牌魚丸、海霸王魚豆腐、海霸王牌蟹柳均購置于杭州永輝超市。

特異肽段標(biāo)準(zhǔn)品EAFGVNMQIV購自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司，純度均大于95%；超純水由Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)制備，其他試劑均為分析純級(jí)別。

2.2 儀器設(shè)備(表1)

表1 主要儀器信息

2.3 液相條件與質(zhì)譜條件

2.3.1液相條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)；柱溫: 40 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：0.15%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序見表2。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫色譜分離條件

2.3.2質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；電噴霧電壓：5500 V；霧化氣壓力：30 Pa；氣簾氣壓力：55 Pa；輔助氣壓力：55 Pa；離子源溫度：550 ℃；去簇電壓：95 V。大豆過敏蛋白特異肽段標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜參數(shù)表3；EPI參數(shù)：當(dāng)MRM響應(yīng)值大于100 CPS時(shí)同時(shí)啟動(dòng)線性離子阱的增強(qiáng)子離子掃描功能；增強(qiáng)子離子掃描范圍：200～1000 Da；掃描速度10000 Da/s；動(dòng)態(tài)填充時(shí)間15 ms。

表3 多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)參數(shù)

注：帶*為定量離子。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

分別精密稱取2.5 mg大豆過敏蛋白特征肽段EAFGVNMQIVR 于5mL容量瓶中，用20%乙腈～80% 0.15%甲酸水溶解定容，配制成500 μg/mL的特征肽段標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。置于-20 ℃冰箱保存，保質(zhì)期為6個(gè)月。

2.5 樣品預(yù)處理

2.5.1蛋白提取

將買來的魚清洗除內(nèi)臟，剔除魚皮和魚骨，絞碎，分裝于-20℃冷藏。稱取2 g處理好的魚肉，加入5 mL 0.2M Tris-HCL,于60℃振蕩2 h，振幅200，冷卻至室溫。8000 rpm/min 10min，取上清液待用。

2.5.2酶解

取500μL上清液，加10μL 500mmol/L DTT，56 ℃水浴加熱30min。然后加入30μL 500mmol/L IAA，室溫下避光靜置30min之后，加入胰蛋白酶(1∶50，w/w，酶與底物濃度比)，在37 ℃水浴中酶切16h。加入5μL 甲酸終止反應(yīng)，于10000rpm/min 離心10min。上清液過0.22μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

2.6 計(jì)算公式

2.6.1基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

將處理好的魚肉作為空白基質(zhì)，精密移取一定量的特征肽段EAFGVNMQIVR儲(chǔ)備液，分別用初始流動(dòng)相和空白基質(zhì)酶解液稀釋配制成1、5、10、20、50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式如下：

式中：slopematrix為空白基質(zhì)曲線的斜率；

slopestandard為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

2.6.2 魚糜制品中過敏蛋白含量的計(jì)算公式

式中：X—魚糜樣品中大豆過敏原蛋白的含量，μg/g；

m—魚糜樣品質(zhì)量，g；

δ—樣品的稀釋倍數(shù)；

c—樣品中特異肽段的含量，ng/mL；

V—樣品酶解的體積， mL；

M1/M2—大豆過敏蛋白與特征肽段的相對(duì)分子質(zhì)量比值

2.6.3加標(biāo)回收率

回收率實(shí)驗(yàn)是空白魚糜酶解液中加入低、中、高3個(gè)水平的特征肽段，經(jīng)過LC-MS/MS檢測(cè)，計(jì)算得出結(jié)果?；厥章实挠?jì)算公式如下：

回收率%=(C-A)/B×100%

式中：A為供試品中被測(cè)組分含量，ng/mL;

B為加入的特異肽段的含量，ng/mL；

C為實(shí)際樣品中組分值，ng/mL。

3 結(jié)果與討論

3.1 特異肽段的篩選

大豆球蛋白(Glycinin)是大豆抗原蛋白中免疫原性最強(qiáng)的因子之一，約占大豆籽實(shí)蛋白總量的40%[17]。Glycinin G2 由485個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為54391 Da，主要引發(fā)免疫蛋白Ig E介導(dǎo)的Ⅰ型過敏反應(yīng)[18]，且耐熱，是大豆過敏蛋白的研究熱點(diǎn)。

建立準(zhǔn)確定量分析蛋白質(zhì)的液質(zhì)聯(lián)用分析方法，特征肽段的選擇至關(guān)重要。本方法在查閱相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[14,19-25]，篩選出2條大豆的特征肽段后進(jìn)行實(shí)際樣品的驗(yàn)證(見表4)。通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)得到2條肽段的母離子質(zhì)荷比信息(圖1)，從液質(zhì)圖中可以看出，2條大豆過敏蛋白肽段響應(yīng)值高，靈敏度好。

表4 大豆過敏蛋白選擇肽段初篩

圖1 2條大豆過敏蛋白肽段的色譜圖(5%大豆添加)

同時(shí)，考慮到b/y離子類型的肽段比a/x型相對(duì)更穩(wěn)定，因此在滿足實(shí)驗(yàn)靈敏度和經(jīng)濟(jì)成本的前提下選擇EAFGVNMQIVR(氨基酸序列位置228-238，相對(duì)分子質(zhì)量1263.49)肽段作為大豆特征肽段，相應(yīng)的特征肽段標(biāo)準(zhǔn)品二級(jí)質(zhì)譜圖見圖2。

3.2 質(zhì)譜參數(shù)及譜庫的建立

3.2.1質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

本研究采用針泵注射大豆蛋白過敏原多肽，在正離子模式下進(jìn)行一級(jí)母離子掃描，得到準(zhǔn)分子離子峰[M+2H]+,然后進(jìn)行子離子掃描得到二級(jí)碎片，根據(jù)獲得的碎片信息建立多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下優(yōu)化化合物去簇電壓、碰撞能量，優(yōu)化后參數(shù)見表3。同時(shí)對(duì)線性離子阱參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化及設(shè)置，參數(shù)為當(dāng)MRM響應(yīng)值大于100 CPS時(shí)同時(shí)啟動(dòng)線性離子阱的EPI掃描功能；EPI掃描范圍：200～1000 Da；掃描速度10000 Da/s；動(dòng)態(tài)填充時(shí)間15 ms。

圖2 特征肽段的二級(jí)質(zhì)譜圖

3.2.2譜庫建立

本研究采用MRM-IDA-EPI掃描譜庫檢索模式。首先從MRM模式獲得化合物的保留時(shí)間、峰面積等信息，在利用EPI掃描獲得的二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行譜庫檢索。將標(biāo)準(zhǔn)溶液采集到的EPI譜圖通過Access編寫導(dǎo)入液質(zhì)數(shù)據(jù)庫，作為標(biāo)準(zhǔn)譜庫。對(duì)實(shí)際陽性可疑樣品進(jìn)行檢測(cè)，用采集到EPI譜圖進(jìn)行譜庫檢索。根據(jù)purity值進(jìn)行排序，purity越接近100%，檢測(cè)到的陽性可疑樣品為目標(biāo)化合物的可能性越大。

3.3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.3.1基質(zhì)效應(yīng)

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是對(duì)質(zhì)荷比進(jìn)行檢測(cè)，因此目標(biāo)化合物的離子化程度是檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵。與純?nèi)軇┫啾?，基質(zhì)的存在能不同程度的影響化合物的電離，抑制或增強(qiáng)其電離的響應(yīng)信號(hào)值。因此實(shí)驗(yàn)測(cè)定了空白基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)將基質(zhì)效應(yīng)(ME)范圍在0.9～1.1之間的認(rèn)定為基質(zhì)效應(yīng)忽略不計(jì)，ME小于0.9的為基質(zhì)效應(yīng)抑制作用，ME大于1.1的為基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)作用。結(jié)果表明，ME=73.5%(見圖3)，對(duì)特異肽段有明顯的抑制作用，表明空白基質(zhì)的存在對(duì)特異肽段的檢測(cè)存在一定程度的干擾，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)加標(biāo)曲線來補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更接近真實(shí)情況。

圖3 溶劑與空白基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3.2方法的線性關(guān)系、LOQ和LOD

分別精密移取特征肽段儲(chǔ)備液，用空白魚糜酶解液稀釋成0.5、1、5、10、20、50、100、200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以特征肽段的濃度為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)做線性回歸方程，該方法的線性方程為：Y=14895X-38916，R2=0.9975。

常用信噪比法確定檢出限與定量限，以空白魚糜酶解液作為基質(zhì)，添加特征肽段儲(chǔ)備液，以該肽段的信噪比為3相應(yīng)的濃度確定檢出限，而以信噪比為10相應(yīng)的濃度確定定量限。結(jié)果顯示，該方法中魚糜制品中大豆過敏原蛋白的定量限為0.108 μg/g。

3.3.3加標(biāo)回收率、精密度

空白魚糜酶解液中添加低中高(1、5、50 ng/mL)3個(gè)濃度特征肽段標(biāo)準(zhǔn)品，得到的峰面積通過工作曲線計(jì)算其回收率。結(jié)果如表5所示，加標(biāo)回收率在78.2～108.3% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于5.9%。

表5 空白魚糜樣品加標(biāo)回收率和精密度

3.4 實(shí)際應(yīng)用

采用模擬加樣的方式，大豆分離蛋白的添加水平設(shè)置為1%、2%、5%，同時(shí)，采用市售的7個(gè)魚糜制品作為實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，采用基質(zhì)加標(biāo)曲線計(jì)算含量值，結(jié)果見表6。

從檢測(cè)的實(shí)際樣品結(jié)果可知，其中丸之尊魚豆腐的配料列表中不含有大豆分離蛋白，但仍檢測(cè)出大豆過敏原， 其含量在0.87 μg/g。對(duì)陽性樣品進(jìn)行EPI掃描譜庫檢索確認(rèn)為大豆過敏蛋白多肽。圖4為實(shí)際樣品的EPI譜圖譜庫檢索結(jié)果。

表6 實(shí)際樣品中大豆過敏原蛋白含量

圖4 實(shí)際樣品增強(qiáng)子離子掃描譜圖譜庫檢索結(jié)果

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立液相色譜-三重四級(jí)桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法快速靈敏的檢測(cè)魚糜制品中痕量大豆過敏原蛋白的分析方法。通過蛋白組學(xué)bottom-up方法成功篩選出大豆過敏蛋白的特征肽段，并采用MRM-IDA-EPI掃描譜庫檢索方法建立了靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢出限低的定性定量方法，其定量限達(dá)到0.108 μg/g，回收率在78.2～108.3%。對(duì)于魚糜制品中痕量的大豆過敏原蛋白的準(zhǔn)確定性定量方法的建立，不僅能為食品標(biāo)簽的規(guī)范化提供理論參考，還能避免過敏人群受到傷害，具有很大的現(xiàn)實(shí)意義。