印伯星，李 艷，瞿恒賢，瓦云超，王春雷，席文博，顧瑞霞*

（1.揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚州 225009；2.揚州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室，江蘇揚州 225009；3.江蘇省乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，江蘇揚州 225004；4.統(tǒng)一企業(yè)（中國）投資有限公司，江蘇昆山215300）

高脂血癥（Hyperlipidemia）是一類血脂代謝紊亂及脂質(zhì)運轉(zhuǎn)異常所導(dǎo)致的疾病，具體表現(xiàn)為血漿中一種或多種脂質(zhì)過高[1]。乳酸菌是一類能利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的微生物[2]，大量乳酸菌菌株具有顯著的益生功能[3]。乳酸菌發(fā)酵乳在改善腸道健康、改善脂質(zhì)代謝、促進免疫發(fā)育、減少或預(yù)防腹瀉、預(yù)防或減輕過敏以及抑制癌癥發(fā)展等方面具有良好的作用[4]。近年來，乳酸菌對血脂的影響水平已在動物模型和人體試驗中得到評價。因此，利用益生乳酸菌發(fā)酵乳作為高脂血癥患者膳食對干預(yù)或輔助治療意義重大。

目前，高脂飲食中乳酸菌及其發(fā)酵乳對腸道菌群穩(wěn)態(tài)的調(diào)控研究更受關(guān)注，但還需要更深入探討益生菌對脂質(zhì)的調(diào)控作用[5]。關(guān)于單一乳酸菌和混合乳酸菌的降血脂效果和機制研究較少。因此，本研究從長壽人群中篩選具有輔助降血脂潛力的乳酸菌制備發(fā)酵乳，借助高脂血癥大鼠模型驗證其體內(nèi)功能，并從腸道菌群角度分析對比單一乳酸菌和混合乳酸菌發(fā)酵乳降低脂質(zhì)水平的機制，為更好地應(yīng)用乳酸菌調(diào)控脂質(zhì)代謝提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 L. rhamnosus LV108、L. fermentum grx08和L. casei grx12 均由江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室分離保藏。

1.2 儀器與設(shè)備 日立7020 全自動生化分析儀（日本Hitachi 公司）；Legend mach1.6R 高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Illumina MiSeq 基因組分析平臺（國Illumina 公司）；BioTek Flx800 酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；DYY-6C 電泳儀（北京天誠沃德生物技術(shù)有限公司）；GloMax 20/20 分光光度計（美國Promega 公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗動物及飼養(yǎng) 試驗選擇體重為（120±10）g 的SD 雄性大鼠40 只，購于揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。飼養(yǎng)環(huán)境采光良好、通風(fēng)清潔，飼養(yǎng)間溫度（23.0±1.0）℃、濕度（50±5）%，維持飲水充足及墊料干燥。

基礎(chǔ)飼料配方按美國營養(yǎng)學(xué)會（AIN）制定的AIN76 標(biāo)準配方配制，高脂飼料配方按10% 豬油、10% 蛋黃粉、1% 膽固醇、0.2% 膽鹽和78.8% 基礎(chǔ)飼料的比例配制。

1.3.2 灌胃發(fā)酵乳的制備 將凍存于-80℃冰箱的試驗菌株分別接入液體MRS 培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，活化3 代，取5%活化后的乳酸菌株接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)至凝乳，調(diào)整活菌數(shù)到1×108CFU/mL，4℃冷藏。LV108 發(fā)酵乳∶grx08 發(fā)酵乳∶grx12 發(fā)酵乳=2∶1∶1（體積比）制備混合乳酸菌發(fā)酵乳。為防儲存過久導(dǎo)致發(fā)酵乳活菌數(shù)降低，灌胃樣品每天下午培養(yǎng)，第2天上午使用。每天10：00 按1 mL/100g 體重灌胃1 次。

1.3.3 動物分組及干預(yù) 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，依照組間平均體重?zé)o顯著差異的原則將大鼠分為4 組：空白對照組（C 組）、高脂模型組（M 組）、L. rhamnosus LV108 發(fā)酵乳干預(yù)組（LV 組）和混合乳酸菌發(fā)酵乳干預(yù)組（H 組），每組10 只。參照文獻[6-7]制備高脂血癥大鼠模型，正常對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，其余各組大鼠均用高脂飼料喂養(yǎng)，試驗共8 周，其中造模4 周，灌胃干預(yù)4 周。造模成功后，C組和M組灌胃給予生理鹽水（1 mL/100 g）；LV 組灌胃給予LV108 發(fā)酵乳（1 mL/100 g，109CFU/mL）；H 組灌胃給予混合乳酸菌發(fā)酵乳（1 mL/100 g，109CFU/mL）。定時補充飲水和飼料，更換墊料。

1.3.4 大鼠臟器指數(shù)測定 灌胃4 周后，小鼠稱體重，眼球取血，頸椎脫臼處死后摘取脾臟、肝臟和心臟，將周圍組織剝離干凈后稱重。

大鼠臟器指數(shù)=大鼠臟器重量/大鼠體重×100%

1.3.5 大鼠血清指標(biāo)測定 灌胃4 周后，對所有大鼠禁食12 h 后，早上脫臼處死，眼球取血并置于非肝素化PE 管中，37℃恒溫孵育30 min 后離心10 min（5 000 r/min，4℃）分離并收集血清。

每只小鼠取眼球血0.5～1 mL 置于1.5 mL 離心管中，靜置1 h 后，3 000 ×g 離心15 min 使得血清充分析出，轉(zhuǎn)移血清至另一離心管，-20℃凍存即為待測樣。按照試劑盒（購自四川邁克生物科技股份有限公司）說明書測定大鼠血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量。

1.3.6 大鼠糞便樣品采集 在造模前后及乳酸菌干預(yù)后采集各組大鼠的新鮮糞便樣品，從中各取1.0 g，用35.0 mL無菌PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）分3 次懸?。合燃?5.0 mL PBS 充分漩渦振蕩5 min 后，剩余PBS 再分2 次加入振蕩，使糞樣懸浮均勻，1 300 r/min 離心5 min，棄沉淀收集上清液。重復(fù)洗滌2 次去除粗顆粒后，8 700 r/min離心3 min，收集沉淀，30.0 mL PBS 洗滌2 次，收集沉淀-80℃保存，用于后續(xù)DNA 提取。其余糞樣應(yīng)在采集后即時置于-80℃超低溫冰箱中凍存。

1.3.7 大鼠糞便DNA 提取 大鼠糞便DNA 的提取嚴格參照QIAam DNA Stool Mini Kit（購自德國Qiagen 公司）說明書的操作步驟進行。

1.3.8 PCR 擴增與產(chǎn)物純化 PCR 擴增引物序列為F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，R：5′-TTACCGCG GCTGCTGGCAC-3′）。反應(yīng)條件：94℃，4 min；94℃，30 s；58℃，30 s；72℃，30 s，30 個循環(huán)，72℃反應(yīng)5 min。25.0 μL擴增體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（10.0 mmol/L）0.5 μL，上、下游引物（10.0 pmol/L）各1.0 μL，Pyrobest DNA 聚合酶（5.0 U/μL）0.125 μL，樣品DNA 20.0 μL，最后用無菌去離子水補足至25.0 μL。

取3.0 μL 擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測，利用DNA Gel Extraction Kit（購自碧云天生物科技股份有限公司）將擴增后的條帶進行回收和純化，取1.0 μL樣品DNA 加入24.0 μL TE 和25.0 μL PicoGreen（稀釋200 倍），置于Costar 半量酶標(biāo)儀上測定熒光強度（激發(fā)光485/20 nm、發(fā)射光528/20 nm）進行分析。

1.3.9 16S rDNA 基因測序 將擴增后的各組糞樣DNA產(chǎn)物送至上海派森諾生物科技有限公司，進行16S rDNA 基因V3-V4 區(qū)通量測序。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 19.0 分析數(shù)據(jù)，Excel 繪制圖表，數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準差表示。組間比較采用ANOVA 單因素方差分析，腸道菌群與血脂水平的相關(guān)性采用雙變量相關(guān)性分析，以P＜0.05 為統(tǒng)計學(xué)判斷標(biāo)準。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵乳對大鼠機體健康表型及血脂的影響由表1 可知，各組大鼠在飼養(yǎng)4 周后體重均有不同程度增加，其中M、LV 和H 組大鼠的終體重均高于C 組（P＜0.05），M 與H 組大鼠的終體重高于LV 組（P＜0.05）。M、LV 和H 組大鼠肥肉肝指數(shù)高于C 組（P＜0.05），其余臟器指數(shù)無顯著性差異。表明大鼠經(jīng)高脂配方飼料喂養(yǎng)后，在一定程度上會對肝臟造成損傷。

由表2 可以看出，M 組大鼠血清中TC、TG 及LDL-C含量最高，HDL-C 含量最低，均與其余3 個組別存在顯著差異。經(jīng)發(fā)酵乳灌胃干預(yù)后，LV 及H 組中大鼠血清中TC、TG 及LDL-C 水平均低于M 組（P＜0.05），而HDL-C 含量低于C 組（P＜0.05）。LV 組大鼠血清中TG和TC 含量均與C 組無顯著性差異；但H 組大鼠血清中TC 含量高于C 組和LV 組（P＜0.05），H 組大鼠TG 含量與C 組及LV 組均無顯著性差異。

2.2 大鼠腸道微生物Alpha 多樣性分析 應(yīng)用高通量測序技術(shù)對不同處理組大鼠糞便菌群進行分析，通過QIIME 軟件對18 個樣品序列進行疑問序列識別和剔除，并對樣品序列數(shù)進行統(tǒng)計，對照組有效序列81 912.33 個，其中優(yōu)勢序列79 482.33，優(yōu)勢序列占比為97.03%；模型組有效序列76 166.33 個，其中優(yōu)勢序列73 526.33 個，優(yōu)勢序列占比為96.53%；LV108 發(fā)酵乳組有效序列79 302.67 個，其中優(yōu)勢序列76 969.33 個，優(yōu)勢序列占比為97.06%；混合發(fā)酵乳組有效序列77 039.33 個，其中優(yōu)勢序列74 856.33 個，優(yōu)勢序列占比為97.17%。在各組樣品的有效序列中，優(yōu)質(zhì)序列比例均占95%以上，表明樣品質(zhì)量較優(yōu)，符合后續(xù)實驗要求。

OTU 數(shù)量和Shannon 指數(shù)反映了大鼠腸道菌群的豐度和多樣性，LV108 發(fā)酵乳組及混合乳酸菌發(fā)酵乳組干預(yù)后大鼠腸道的菌群豐度和多樣性。由表3 可見，各組大鼠糞便的OTU 數(shù)量和Alpha-多樣性存在差異，其中，M 組大鼠的OTU 數(shù)量和Alpha-多樣性低于其他各組（P＜0.05），表明飼喂高脂飼料顯著降低了大鼠腸道菌群的豐度和Alpha-多樣性，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵乳干預(yù)后，大鼠的腸道菌群豐度和Alpha-多樣性上升（P＜0.05），其中H 組OUT 數(shù)量與C 組有顯著性差異；此外，H 組大鼠Chao1 高于LV 組（P＜0.05）。

2.3 大鼠腸道微生物物種組成差異性分析 應(yīng)用QIIME軟件獲取各樣本在門、屬水平上的組成和豐度分布表，并通過柱狀圖呈現(xiàn)。由圖1 可知，在細菌門水平上共檢測出11 個菌門，各試驗大鼠腸道菌在門水平上整體的群落結(jié)構(gòu)差異不大，均主要由擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）及放線菌門（Actinobacteria）組成，其中擬桿菌門、厚壁菌門及變形菌門相對豐度之和大于80%，是大鼠糞便中的主要優(yōu)勢菌門。

表1 大鼠體重及臟器指數(shù)（n=10）

表2 大鼠血清中TC、TG、HDL-C 及LDL-C 變化情況（n=10） mmol/L

表3 各組OTU 數(shù)量及多樣性分析（n=10）

圖1 大鼠腸道微生物門水平相對豐度變化

由圖2 可知，實驗共檢測到大鼠腸道內(nèi)的90 余個屬的微生物，M 組、LV 組和H 組中大鼠腸道36 個屬的微生物的豐度被改變。大鼠腸道在屬水平上的微生物主要 為Lactobacillus spp.、S24-7 spp.、Treponema spp.、Peptostreptococcus spp.、Clostridium spp.、Plasmodium spp.、Escherichia spp.、Rumenococcus spp.、Desulfovibrio spp.、Clostridium spp.、Bacteroides spp. 和Treponema spp.。

由表4 可知，在菌門水平上，C 組大鼠糞便中擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度顯著下降，而厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度顯著增加；經(jīng)益生菌干預(yù)后，LV 組及H 組大鼠糞便內(nèi)擬桿菌門的相對豐度顯著增加，厚壁菌門和變形菌門的相對豐度顯著下降。其中，LV 組大鼠糞便中厚壁菌門、擬桿菌門及疣微菌門（Verrucomicrobia）相對豐度已與C 組無顯著性差異，而H 組大鼠糞便中放線菌門（Actinobacteria）相對豐度與C 組無顯著性差異。

在菌屬水平上，LV 組和H 組中大鼠腸道內(nèi)Lactobacillus spp.、S24-7 spp.、Treponema spp. 及Prevotella spp.的豐度高于M 組（P＜0.05），LV 組和H 組中大鼠腸道 內(nèi)Peptostreptococcus spp.、Clostridium spp.、Turicibacter spp.、Escherichia spp.及Desulfovibrio spp.的豐度低于M 組（P＜0.05）， 同 時LV 組 中Bifidobacterium spp.的豐度高于M 組和H 組（P＜0.05）。

圖2 大鼠腸道微生物屬水平相對豐度變化

2.4 大鼠腸道微生物物種主成分分析 Beta 多樣性分析用于表示菌群之間的相似度。由圖3 可知，PC1 解釋了48.17%的變異，PC2 解釋了30.61%的變異，共解釋了總變異的78.77%。各組大鼠腸道菌群樣品無明顯的交叉和重疊，說明各組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)有明顯的區(qū)分，也說明持續(xù)高脂膳食和益生菌干預(yù)都會對大鼠腸道菌群的多樣性造成一定的擾動。其中，LV 組與H 組中大鼠腸道菌群距離接近，又都較為接近建模前組遠離高脂模型組，表明飼喂2 種發(fā)酵乳均對改善高脂模型組情況有良好效果，使其有向正常組恢復(fù)的趨勢，且2 組發(fā)酵乳對大鼠菌群的影響較為接近，無顯著區(qū)別。

2.5 大鼠腸道微生物物種聚類分析 將屬水平上的分類信息繪制成熱圖（heat-map）用以分析大鼠腸道微生物組成的相似性。由圖4 可以看出，LV 組與H 組聚為一類，又和C 組聚為一類，其中LV 組和C 組更為接近。

表4 各組大鼠腸道菌群的主要差異物（n=3） %

圖3 大鼠腸道微生物多樣性的主成分分析

圖4 大鼠腸道微生物聚類圖

2.6 大鼠腸道菌群與血脂相關(guān)性分析 如表5 所示，大 鼠 血 清 中TC 含 量 與S24-7 spp.、Treponema spp. 及Prevotella spp.相對豐度呈顯著負相關(guān)，而與Escherichia spp. 呈極顯著正相關(guān)。血清TG 含量與Lactobacillus spp.、S24-7 spp.及Prevotella spp.相對豐度呈顯著負相關(guān)；血清HDL-C 含量與Treponema spp.相對豐度呈極顯著正相關(guān)，而與Bifidobacterium spp.相對豐度呈顯著負相關(guān)；血清LDL-C 含量與Lactobacillus spp.、S24-7 spp.及Prevotella spp.相對豐度呈顯著負相關(guān)，而與Clostridiales spp.、Escherichia spp. 和Desulfovibrio spp.呈顯著正相關(guān)。

3 討 論

本研究顯示，LV 組和H 組能夠顯著影響高血脂大鼠血清中的TC、TG、LDL-C 含量，表明益生菌發(fā)酵乳對高脂膳食誘導(dǎo)的高脂血癥血脂具有一定的改善作用。其中，LV 組大鼠血清TC 水平顯著低于H 組，表明L.rhamnosus LV108 發(fā)酵乳在降低宿主血清膽固醇水平方面優(yōu)于混合乳酸菌發(fā)酵乳，L. rhamnosus LV108 發(fā)酵乳與混合乳酸菌發(fā)酵乳對大鼠腸道菌群的調(diào)控可能存在差異，進而影響膽固醇的吸收與排出。

已有文獻表明，高脂飲食導(dǎo)致大鼠體內(nèi)脂類代謝產(chǎn)生次級膽酸、硫化氫等產(chǎn)物損害大腸黏膜，破壞了菌群的生存微環(huán)境[7]，使腸道菌群通過間接調(diào)整細胞脂肪酸的攝入來促進血脂在脂肪組織的儲存，并分泌載脂蛋白加速脂肪組織中TG 的累積[8]，從而促進了大鼠血脂的升高。本研究發(fā)現(xiàn)，L.rhamnosus LV108 發(fā)酵乳及混合乳酸菌發(fā)酵乳具有恢復(fù)高血脂引起的大鼠腸道菌群的紊亂的效應(yīng)。聚類分析的結(jié)果也顯示，L.rhamnosus LV108 及混合乳酸菌發(fā)酵乳對高脂模型大鼠進行干預(yù)可以調(diào)節(jié)大鼠的腸道菌群，使其菌群構(gòu)成與空白對照組大鼠的菌群構(gòu)成更為接近。L.rhamnosus LV108 發(fā)酵乳及混合乳酸菌發(fā)酵乳通過調(diào)節(jié)菌群豐度及結(jié)構(gòu)，改善了腸道內(nèi)參與脂質(zhì)及碳水化合物代謝的微生物組表達[9]，進而恢復(fù)大鼠血脂水平。

由于高脂飼料中的磷脂、膽酸鈉等脂類在代謝過程中產(chǎn)生了有利于Escherichia spp.及Clostridium spp.生長的內(nèi)毒素等物質(zhì)[10-11]，促進了大鼠腸道內(nèi)Escherichia spp. 及Clostridium spp. 等菌的繁殖，并破壞了腸道的微生態(tài)環(huán)境。同時高脂飼料中的膽汁酸等物質(zhì)對腸道中有益微生物產(chǎn)生膽汁壓力、酸化細胞、氧化和滲透壓等毒害效應(yīng)，從而抑制了雙歧桿菌等菌群生長[10]。L.rhamnosus LV108 發(fā)酵乳中的活菌可以通過粘附腸道上皮細胞來增加腸道乳酸菌數(shù)量，與致病菌競爭粘附位點，抑制Escherichia spp. 等致病菌繁殖[12]，促進腸道內(nèi)Bifidobacterium spp. 等有益菌生長[13]；同時，發(fā)酵乳中的其他發(fā)酵代謝產(chǎn)物對腸道菌群也可能產(chǎn)生有益影響[14]，但具體成分及構(gòu)效尚有待進一步研究。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，較單菌株發(fā)酵乳而言，混合菌株發(fā)酵乳更有利于含有細胞活素的細胞數(shù)量的增加，從而減少微生物細胞的凋亡[14]；同時，混合發(fā)酵乳中不同乳酸菌的定植能與更多的致病菌競爭吸附位點，其代謝產(chǎn)物的種類也更為豐富，為益生菌的生長提供更好的生存環(huán)境，促進腸道的生態(tài)平衡[13]，因而混合乳酸菌發(fā)酵乳對腸道菌群的改善效果要好于單一乳酸菌發(fā)酵乳。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)單一及混合乳酸菌發(fā)酵乳能顯著改善大鼠血脂水平并恢復(fù)大鼠腸道菌群的多樣性及菌群構(gòu)成。L. rhamnosus LV108 及其混合發(fā)酵乳均可顯著降低大鼠血清中TC、TG 及LDL-C 含量，抑制體重增長，并顯著提高了大鼠腸道菌群的豐度及多樣性，其中混合乳酸菌發(fā)酵乳干預(yù)的大鼠腸道菌群的豐度顯著高于L.rhamnosus LV108 發(fā)酵乳組。

表5 大鼠腸道菌群與血脂相關(guān)性分析