丁 赫，郭樂薇，徐高青，王 軍，呂文發(fā)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林省反芻動物繁育生物技術(shù)與健康養(yǎng)殖工程實驗室，吉林長春130118）

生物鐘通過外部信號和內(nèi)部時間系統(tǒng)之間的協(xié)調(diào)，調(diào)控著機(jī)體的代謝、激素水平、體溫、睡眠等生化和生理過程。生物鐘是一種基于轉(zhuǎn)錄翻譯的反饋回路，使基因和蛋白以24 h 為周期循環(huán)表達(dá)，并且當(dāng)外界晝夜交替的現(xiàn)象消失時，這樣的節(jié)律一直存在[1-3]。在生物鐘系統(tǒng)中，BMAL1 和CLOCK 是核心的生物鐘基因，它們通過與目的基因啟動子的特異元件E-boxes 結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[4-5]。晝夜節(jié)律機(jī)制被破壞影響著機(jī)體的生理狀況，可能導(dǎo)致肥胖、衰老、哮喘、癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等多種疾病[6-9]。哺乳動物的睪丸主要包括支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞2 種細(xì)胞，具有產(chǎn)生精子和雄激素的重要作用。有研究表明，在小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中存在BMAL1 蛋白的表達(dá)，并且呈現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律規(guī)律[10]，但BMAL1 對小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響仍不清楚。本實驗利用qRT-PCR、Western Blot 和流式細(xì)胞技術(shù)研究敲減BMAL1 對小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡水平及凋亡相關(guān)蛋白（BAX 和BCL-2）表達(dá)的影響，明確BMAL1對小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 BMAL1 siRNA 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)說明書操作，將離心管3 000 r/min 離心1 min，取125 μL DEPC 水加入到離心管中，配制成20 μmol/L 溶液。將小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司，CL-0234）傳代至6 孔板中，1×105個/孔，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞24 h，待細(xì)胞完全貼壁，細(xì)胞生長到80%～90%時開始轉(zhuǎn)染。10 μL LipofectamineTM2000 加入到250 μL 普通培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫孵育5 min；9 μL BMAL1 siRNA 和BMAL1 siRNA NC（Negative Control），siRNA 序列見表1，分別加入到250 μL 的普通培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫孵育5 min。將前兩步的預(yù)混液混合，室溫孵育20 min。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，使用無雙抗的PBS 清洗2～3 次，添加1.5 mL 無血清、無雙抗的普通細(xì)胞培養(yǎng)液，同時將孵育好的混合液分別添加至6 孔板的細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻，放到37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。6 孔板中細(xì)胞培養(yǎng)6 h 后，添加200 μL血清至培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)18～42 h，提取RNA 和蛋白，進(jìn)行檢測。

1.2 流式細(xì)胞術(shù) 將已轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞棄上清，用PBS洗2～3 次，使用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min 離心5 min 棄上清，并用PBS 清洗2～3 次，收集細(xì)胞。使用凋亡檢測試劑盒FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I（BD），10X Annexin V BindingBuffer 與蒸餾水1∶9 配制1×Binding Buffer，向裝有細(xì)胞沉淀的管中加入200 μL 1×Binding Buffer，每管中分別 加 入5 μL FITC Annexin V 和5 μL Propidium Iodide(PI) ，并設(shè)立3 組對照：空白不染色組、PI 單染組和FITC 單染組，輕柔混勻后室溫避光孵育15 min。結(jié)束后，再加入200 μL 1×Binding Buffer，過濾網(wǎng)至流式管中，立即上機(jī)檢測。

表1 BMAL1 siRNA 序列

1.3 qRT-PCR 采 用RNAiso Plus（TaKaRa） 提 取 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于qRT-PCR 實驗，根據(jù)TaKaRa 的反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求，利用RNA 的濃度值計算反轉(zhuǎn)錄20 μL cDNA 所需的RNA量。本實驗所需的基因引物序列見表2。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計及合成，并利用PCR 儀進(jìn)行引物驗證，摸索引物的最適反應(yīng)條件。利用熒光定量PCR 儀 對BMAL1 siRNA 組 和BMAL1 siRNA NC組進(jìn)行相關(guān)基因的分析。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL、Forward primer 0.8 μL（0.4 μmol/L）、Reverse primer 0.8 μL（0.4 μmol/L）、ROX reference Dye Ⅱ0.4 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 至 20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性30 s；95℃ 變性5 s，40 個循環(huán)；56（59）℃退火34 s，擴(kuò)增40 個循環(huán)。運(yùn)用 2－△△Ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表2 基因引物合成信息

1.4 Western Blot 根據(jù)蛋白大小分別配制10% 和15%聚丙烯酰胺凝膠，BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）測定蛋白濃度，上樣20 μg/ 孔。80 V電壓電泳至分離膠，變?yōu)?60 V 電壓電泳至結(jié)束。采用半干轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件0.12 A 28 min，將目的蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜（NC 膜）上。采用封閉液封閉1.5 h，一抗（1∶1 000）BMAL1（CST，14020S）、BAX（abclonal，A12009）和BCL-2（abclonal，A11025），4℃孵育過夜，TBST 洗3 次，每次5 min 。孵育二抗（1∶10 000），室溫1 h，TBST 洗3 次，每次5 min 。最后用ECL 發(fā)光液顯影，用Tanon Gis 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS17.5 軟件進(jìn)行t 檢驗，比較組間差異性，數(shù)據(jù)用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用GraphPad Prism 5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMAL1 siRNA 驗證 如圖1-A 所示，與NC 組相比，3 組siRNA 均能降低小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)BMAL1 的表達(dá)（P＜0.01），干擾效率在30%～40%。為了提高siRNA 干擾效率，采用混合siRNA 干擾策略[11]，即siRNA546 ∶siRNA934∶siRNA1057=1∶1∶1， 如 圖1-B 顯 示， 混 合siRNA 干擾能夠提高干擾效率（50%～60%），用于后續(xù)的實驗處理。Western Blot 結(jié)果顯示（圖1-C），與NC組相比，siRNA 干擾組BMAL1 蛋白表達(dá)量下降（P＜0.05）。

2.2 細(xì)胞凋亡水平檢測結(jié)果 如圖2 所示， BMAL1 表達(dá)下降時，與NC 組相比，凋亡水平升高（P＜0.05）。

2.3 qRT-PCR 檢測凋亡相關(guān)基因 如圖3 所示，在BMAL1 基因被干擾后，促凋亡基因BAX 上升（P＜0.01），抑凋亡基因BCL-2 下降（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，敲減BMAL1 基因表達(dá)促進(jìn)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡。

2.4 Western Blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白 由圖4 可知，使用siRNA 干擾小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中BMAL1 的蛋白表達(dá)，促凋亡基因BAX 蛋白表達(dá)量升高（P＜0.01），同時，抑凋亡相關(guān)基因BCL-2 的蛋白表達(dá)量下降（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，當(dāng)BMAL1 的蛋白表達(dá)量下降時，將會導(dǎo)致小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平升高，與qRT-PCR 結(jié)果一致。

3 討 論

已有研究發(fā)現(xiàn)，生物節(jié)律基因BMAL1 在睪丸組織中有表達(dá)，但是其對睪丸細(xì)胞凋亡的影響還不清楚[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過敲減BMAL1 表達(dá)可促進(jìn)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡且伴隨著促凋亡蛋白BAX 顯著上調(diào)，抑凋亡蛋白BCL-2 顯著下調(diào)，表明BMAL1 可抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡。

圖1 BMAL1 siRNA 干擾效率驗證

圖2 BMAL1 siRNA 對睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡水平影響

圖3 干擾BMAL1 基因?qū)Φ蛲鱿嚓P(guān)基因表達(dá)的影響

圖4 干擾BMAL1 基因凋亡相關(guān)蛋白BAX 和BCL-2 的表達(dá)

晝夜節(jié)律調(diào)控著動物的生理生化過程，晝夜節(jié)律破壞會導(dǎo)致各種病理現(xiàn)象發(fā)生，尤其是對動物的生殖生理有著重要影響[6,12]。已有研究表明，生物節(jié)律基因BMAL1 在下丘腦、垂體和睪丸中均有表達(dá)，并發(fā)揮著重要功能[10,13-14]。為檢測BMAL1 對小鼠生殖能力的影響，Alvarez 等[15]通過敲除雄性小鼠和雌性小鼠的BMAL1 基因，發(fā)現(xiàn)2 只小鼠均不育，而且影響雄性小鼠血清中的睪酮濃度，說明BMAL1 基因被敲除后導(dǎo)致小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞存在缺陷，影響小鼠性腺發(fā)育和功能。已有多項研究發(fā)現(xiàn)，BMAL1 基因調(diào)控著細(xì)胞凋亡水平。Sun 等[16]通過敲減BMAL1 和CLOCK 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)生物節(jié)律基因能夠影響紫外線引發(fā)的人角質(zhì)形成細(xì)胞（HKCs）的凋亡水平。在哺乳動物中，顆粒細(xì)胞與卵泡發(fā)育及卵巢功能密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，抑制BMAL1 基因的表達(dá)能夠促進(jìn)豬顆粒細(xì)胞凋亡，并且降低激素合成相關(guān)基因CYP11A1、CYP19A1 和STAR 基因的表達(dá)，影響顆粒細(xì)胞的生理功能[17]。在大鼠卵巢細(xì)胞的研究中，生物節(jié)律基因的改變同樣會影響卵泡的發(fā)育、黃體化和細(xì)胞凋亡[18]。同樣的，在HL-60 細(xì)胞系中，敲除BMAL1 基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除組HL-60 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡水平明顯高于對照組，說明敲除 BMAL1基因促進(jìn) HL-60 細(xì)胞的凋亡[19]。在小鼠骨髓細(xì)胞中生物鐘基因具有保護(hù)作用以防止細(xì)胞的凋亡[20]。已有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡的啟動與促凋亡基因BAX 及抑凋亡基因BCL-2 的比率有關(guān)，高表達(dá)的BCL-2 蛋白能夠與BAX 蛋白形成異二聚體，減少細(xì)胞死亡，而高濃度的BAX 蛋白會形成同二聚體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。目前BMAL1 對凋亡相關(guān)蛋白BCL-2 和BAX 表達(dá)作用的報道極少，在人肝癌細(xì)胞系中使用siRNA 敲低BMAL1基因的表達(dá)，導(dǎo)致凋亡蛋白BAX 和Cleaved caspase 3顯著升高[22]。但有人發(fā)現(xiàn)另一個時鐘基因CLOCK 可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白BAX 和BCL-2 調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡水平。Li 等[23]利用CLOCK shRNA 轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)CLOCK 低表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡水平升高，Western Blot 發(fā)現(xiàn)促凋亡基因BAX 和Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)顯著增加，抑凋亡基因BCL-2 的蛋白表達(dá)顯著下降。以上研究表明，生物節(jié)律基因BMAL1 能降低細(xì)胞的凋亡水平。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，敲減BMAL1 可導(dǎo)致小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡水平上升及凋亡相關(guān)基因BAX 及BCL-2 的表達(dá)量上升，提示BMAL1 抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡。