安雪姣，趙生國(guó)，潘章源，文禹粱，田志龍，蔡 原*，儲(chǔ)明星*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；3.臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東臨沂 276005)

KISS1 基因最初是Lee 等從人黑色素瘤細(xì)胞中分離得到，具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，被定位于人的1q32-41[1-2]。KISS1 基因的翻譯產(chǎn)物Kisspeptin 是由145 個(gè)氨基酸組成的親水性蛋白，具有分泌神經(jīng)肽的特點(diǎn)，是G 蛋白偶聯(lián)受體54（GPR54）的配體，并組成KISS1/GPR54 系統(tǒng)[3]，該系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）繁殖調(diào)節(jié)中起中樞調(diào)控作用[4]。研究表明，給非繁殖季節(jié)的綿羊體內(nèi)注射Kisspeptin 能顯著提高促黃體素（LH）和促性腺激素釋放激素（GnRH）水平，從而導(dǎo)致綿羊排卵[5]。說(shuō)明KISS1 基因能直接調(diào)節(jié)LH 和GnRH 的合成與分泌，從而促進(jìn)動(dòng)物的季節(jié)性繁殖活動(dòng)[5-6]。

我國(guó)大多數(shù)綿羊品種屬于季節(jié)性繁殖，僅有少數(shù)品種為常年發(fā)情。小尾寒羊是我國(guó)特有的優(yōu)良地方品種，一年四季均可發(fā)情繁殖。草地型藏羊?qū)儆诩竟?jié)性繁殖綿羊，一般在秋冬發(fā)情繁殖。本研究分別采集小尾寒羊和草地型藏羊10 種繁殖相關(guān)組織樣品，檢測(cè)KISS1 基因在這2 個(gè)綿羊品種不同組織中的表達(dá)差異，并對(duì)重測(cè)序篩選出來(lái)的KISS1 基因g.1317523C＞T 和 g.1311578G＞T位點(diǎn)在6 個(gè)綿羊品種中的多態(tài)性進(jìn)行分析，初步分析KISS1 基因在綿羊季節(jié)性繁殖中的作用，以及其多態(tài)性與綿羊產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系，為進(jìn)一步開(kāi)展綿羊季節(jié)性繁殖的研究和分子標(biāo)記輔助育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)選擇生長(zhǎng)狀況良好、飼養(yǎng)時(shí)間相同（2～3 周歲）的西藏當(dāng)雄縣的草地型藏羊和山東省鄆城縣的小尾寒羊經(jīng)產(chǎn)空懷母羊各3 只。屠宰后，迅速采集大腦、小腦、下丘腦、垂體、卵巢、子宮、輸卵管、腎臟、甲狀腺、腎上腺共10 種組織新鮮樣品，裝入2 mL 凍存管，液氮中保存，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

多態(tài)性分析實(shí)驗(yàn)：21 只蘇尼特羊血液樣本采自?xún)?nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗民羊牧業(yè)有限責(zé)任公司，22 只灘羊血液樣本采自寧夏鹽池縣寧夏朔牧鹽池灘羊繁育有限公司，161 只草地藏羊血液樣本采自西藏當(dāng)雄縣，101 只湖羊血液樣本采自江蘇省徐州申寧羊業(yè)有限公司，52 只策勒黑羊血液樣本采自新疆和田市策勒縣，380 只小尾寒羊血液樣品采自山東省鄆城縣誠(chéng)聯(lián)小尾寒羊種羊場(chǎng)。采用頸靜脈采血，檸檬酸葡萄糖抗凝-20℃保存。同時(shí)記錄小尾寒羊產(chǎn)羔季節(jié)、胎次與產(chǎn)羔數(shù)。

1.2 組織總RNA 的提取和檢測(cè) 使用Trizol（Invitrogen，美國(guó)）和動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒（天根生化有限責(zé)任公司，北京）提取藏羊和小尾寒羊各組織總RNA。用NanoDrop 2000 檢測(cè)所提取RNA 的濃度及純度（A260/A280在1.8～2.1），用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 綿羊KISS1 基因mRNA 序列（登錄號(hào)：NM_001306104.1）使用Primer Premier 5.0軟件跨外顯子設(shè)計(jì)引物，以β-actin（GenBank 登錄號(hào)：NM_001009784）作為內(nèi)參基因。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。引物具體信息見(jiàn)表1。

表1 綿羊KISS1 基因的引物信息

1.4 cDNA 合成和qPCR 參考周梅等[7]、李曉雨等[8]的cDNA 合成方法和qPCR 體系和程序，繪制目的基因和持家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)引物的擴(kuò)增效率，并確保其在95%～105%，進(jìn)行qPCR 反應(yīng)以檢測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 基因分型 采用Sequenom MassARRAY?SNP 技術(shù)[9]對(duì)KISS1 基因g.1317523C＞T 和 g.1311578G＞T 位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)。分型樣品為DNA，每個(gè)樣品需要量為20 μL，DNA 濃度為40～80 ng/μL。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)分析 ：采用2-△△CT法[10-11]計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P＜0.05 表示差異顯著。

基因分型數(shù)據(jù)分析參考本課題組田志龍等[12]的分析方法用Excel 2016 軟件統(tǒng)計(jì)綿羊KISS1 基因2 個(gè)SNPs 的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne），然后進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，用SPSS 19.0 軟件對(duì)小尾寒羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 提取與cDNA 合成 提取小尾寒羊和草原型藏羊各組織的總RNA，濃度均在100 mg/μL 以上，A260/A280均在1.8～2.1。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，28 S 和18 S條帶清晰可見(jiàn)，28 S 亮度高于18 S，且無(wú)拖帶現(xiàn)象，說(shuō)明提取的總RNA 無(wú)明顯降解（圖1）。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 以持家基因β-actin 進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增后，產(chǎn)物干凈單一（圖2），表明提取的RNA 和合成的cDNA 可用于后面的qPCR 試驗(yàn)。

圖1 不同品種綿羊10 種組織RNA 電泳檢測(cè)

圖2 不同品種綿羊10 種組織中β-actin 持家基因RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 KISS1 基因在小尾寒羊和草地型藏羊中的表達(dá) 如圖3 所示，KISS1 基因在2 個(gè)綿羊品種的10 種組織均有一定表達(dá)，在腎臟、腎上腺和輸卵管中表達(dá)量很低。小尾寒羊下丘腦、大腦、垂體和甲狀腺組織中KISS1基因的表達(dá)量高于草地型藏羊（P＜0.05）。

圖3 KISS1 基因在小尾寒羊和草地型藏羊各組織間的表達(dá)

2.3 KISS1 基因多態(tài)性分析 如圖4 所示，KISS1 基因g.1317523C＞T 位點(diǎn)在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種中均存在3 種基因型，分別是CC、CT 和TT；g.1311578G＞T 位點(diǎn)在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種中也存在3 種基因型，分別是GG、GT 和TT。

由表2 可知，綿羊KISS1 基因g.1317523C＞T 位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種間差異均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），且無(wú)論在常年發(fā)情還是季節(jié)性發(fā)情品種中C 均是優(yōu)勢(shì)等位基因；g.1311578G＞T 位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種間差異不顯著，且在季節(jié)性發(fā)情和常年發(fā)情綿羊品種中G 均是優(yōu)勢(shì)等位基因。

從表3 可知，綿羊KISS1 基因g.1317523C＞T 位點(diǎn)在小尾寒羊、灘羊、蘇尼特羊、策勒黑羊、湖羊和草原型藏羊6 個(gè)群體中均表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）；卡方適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，該位點(diǎn)在小尾寒羊、灘羊、蘇尼特羊和湖羊4 個(gè)群體中均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P＞0.05），而在草地型藏羊和策勒黑羊中處于不平衡狀態(tài)。g.1311578G＞T 位點(diǎn)在小尾寒羊、灘羊、策勒黑羊、湖羊和草地型藏羊5 個(gè)綿羊群體中表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25），在蘇尼特羊中表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）；卡方適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，該位點(diǎn)在蘇尼特羊和湖羊品種中均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P＞0.05），而在灘羊、小尾寒羊、草地型藏羊和策勒黑羊中均處于不平衡狀態(tài)。

圖4 KISS1 基因g.1317523C＞T（A）與g.1311578G＞T（B）的分型結(jié)果

2.4 KISS1 基因2 個(gè)SNPs 位點(diǎn)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系 由表4 可知，KISS1 基因2 個(gè)SNPs 位點(diǎn)多態(tài)性與小尾寒羊不同胎次產(chǎn)羔數(shù)之間并無(wú)顯著相關(guān)（P＞0.05），但從整體產(chǎn)羔水平來(lái)說(shuō)，g.1311578G＞T 位點(diǎn)TT 型產(chǎn)羔數(shù)大于GT 和GG 型。

3 討 論

3.1 KISS1 基因表達(dá)分析 KISS1 基因在嚙齒動(dòng)物和哺乳動(dòng)物的季節(jié)性繁殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用[13]，在人、豬、山羊等多個(gè)組織廣泛表達(dá)[14-16]。小尾寒羊和阿勒泰羊中的研究發(fā)現(xiàn)，KISS1 基因在綿羊下丘腦中的表達(dá)變化有明顯的周期性，其中在發(fā)情期的表達(dá)量極顯著高于其他階段（發(fā)情前期、發(fā)情后期和間情期）[17-18]。KISS1 基因mRNA 在雌性小鼠下丘腦中的性發(fā)育早期表達(dá)很高，并在性成熟期到達(dá)最高峰，表明KISS1 基因在雌鼠的性發(fā)育早期開(kāi)始分泌，從而激活GnRH 的合成與分泌[19]。在常年發(fā)情山羊（濟(jì)寧青山羊和金堂黑山羊）與季節(jié)性發(fā)情山羊（遼寧絨山羊和藏山羊）中的研究發(fā)現(xiàn)，KISS1 基因在下丘腦中的表達(dá)均顯著高于其他組織，且在常年發(fā)情山羊下丘腦的表達(dá)量顯著高于季節(jié)性發(fā)情山羊[16,20]。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果相似，在小尾寒羊（常年發(fā)情）下丘腦、大腦、垂體和甲狀腺組織的表達(dá)量均顯著高于草地型藏羊（季節(jié)性發(fā)情）。說(shuō)明下丘腦KISS1 基因的差異表達(dá)可能是引起小尾寒羊和草地型藏羊季節(jié)性繁殖差異的重要原因之一。推測(cè)該基因在綿羊季節(jié)性繁殖調(diào)控中起重要作用。

表2 KISS1 基因2 個(gè)SNPs 位點(diǎn)在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率

表3 KISS1 基因2 個(gè)SNPs 位點(diǎn)在不同綿羊品種中的群體遺傳學(xué)分析

表4 KISS1 基因2 個(gè)SNPs 位點(diǎn)各基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

3.2 KISS1 基因多態(tài)性與動(dòng)物繁殖之間的關(guān)系 目前，有關(guān)KISS1 基因的多態(tài)性研究主要集中在人的中樞性性早熟[21]以及動(dòng)物產(chǎn)羔性狀[22]等方面，而KISS1 基因的多態(tài)性與動(dòng)物季節(jié)性繁殖關(guān)系的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，KISS1 基因的SNPs 位點(diǎn)（g.1317523C＞T）在不同繁殖特性（季節(jié)性發(fā)情和常年發(fā)情）綿羊群體的基因型頻率和等位基因頻率均達(dá)到極顯著水平，且常年發(fā)情的綿羊群體等位基因T/C 比值（0.79）高于季節(jié)性發(fā)情的綿羊群體（0.35）。表明該位點(diǎn)T 等位基因與綿羊常年發(fā)情性狀具有相關(guān)性，推測(cè)該位點(diǎn)突變對(duì)綿羊的季節(jié)性繁殖有一定的影響，但其具體的影響機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。

金慧慧[23]研究發(fā)現(xiàn)，將豬KISS1 基因轉(zhuǎn)進(jìn)小鼠體內(nèi)，會(huì)在小鼠下丘腦內(nèi)檢測(cè)到KISS1 基因的表達(dá)，并且轉(zhuǎn)基因小鼠每窩產(chǎn)仔數(shù)均高于野生型小鼠，推測(cè)KISS1基因的表達(dá)可能對(duì)小鼠產(chǎn)仔數(shù)有影響。An 等[24]在薩能奶山羊、波爾山羊和關(guān)中奶山羊3 個(gè)群體KISS1 基因的內(nèi)含子1 上均檢測(cè)出了2 個(gè)SNPs 位點(diǎn)（G2124T＞A和G2270C＞T），且都與山羊的產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)。Martia 等[25]在印度山羊KISS1 基因內(nèi)含子1 上發(fā)現(xiàn)了3 個(gè)與山羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的SNPs 位點(diǎn)（G296C、G2510A和C2540T）。陳祥等[26]在黔北麻羊KISS1 基因內(nèi)含子1 中發(fā)現(xiàn)的2 個(gè)SNPs 位點(diǎn)（G277C、T486A）與其產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)。本研究在小尾寒羊KISS1 基因上檢測(cè)到了2 個(gè)SNPs 位點(diǎn)，其多態(tài)性與小尾寒羊不同胎次產(chǎn)羔數(shù)均無(wú)顯著相關(guān)，但g.1311578G＞T 位點(diǎn)TT 型產(chǎn)羔數(shù)大于GT 和GG 型，推測(cè)該位點(diǎn)突變?cè)谝欢ǔ潭壬显黾恿诵∥埠虻漠a(chǎn)羔能力。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，KISS1 基因在小尾寒羊（常年發(fā)情）下丘腦、垂體、大腦和甲狀腺的表達(dá)量顯著高于草地型藏羊（季節(jié)性發(fā)情）。綿羊KISS1 基因g.1317523C＞T位點(diǎn)與季節(jié)性發(fā)情顯著相關(guān)，可作為常年發(fā)情綿羊選育的輔助標(biāo)記，而g.1311578G＞T 位點(diǎn)對(duì)綿羊產(chǎn)羔性狀選育有潛在調(diào)控作用。