從嬌嬌，張雷，覃曉慧，張峻穎，吳春勇

(1.中國藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；2.中國藥科大學(xué)藥物分析系，南京 210009；3.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南 250101；4.中國藥科大學(xué)中藥制劑教研室，南京 211198)

附子是毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)子根的加工品，可回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛[1]，具有抗心力衰竭、鎮(zhèn)痛、抗癲、抗腫瘤等多種藥理作用[2-8]。但其治療窗較窄，不當(dāng)使用會發(fā)生神經(jīng)毒性、心力衰竭等多種不良反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡[9-12]。因此，闡明附子毒性生物堿的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，對臨床安全用藥具有重要的指導(dǎo)意義。附子主要活性和毒性由雙酯型生物堿，如烏頭堿(aconitine)、新烏頭堿(mesaconitine)和次烏頭堿(hypaconitine)決定。LI等[13]發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃給予由泥附子炮制而成的黑順片后，肝臟的毒性作用具有劑量依賴性。NIITSU等[14]發(fā)現(xiàn)烏頭堿和新烏頭堿在人體肝臟中具有較高的組織分布。然而，筆者未見國內(nèi)外關(guān)于肝臟對附子毒性生物堿轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制方面的報(bào)道。人原代肝細(xì)胞是研究藥物代謝和毒性的體外金標(biāo)準(zhǔn)[15]，但其來源不易，個(gè)體間差異較大且價(jià)格昂貴，應(yīng)用受到很大的限制[16]。來源于人肝胚胎瘤細(xì)胞的HepG2細(xì)胞表達(dá)有多種重要的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，已用于槲皮素-3-硫酸酯、維生素B1等多個(gè)藥物的肝臟攝取轉(zhuǎn)運(yùn)研究[17]。本實(shí)驗(yàn)以HepG2細(xì)胞為體外模型，首次從細(xì)胞水平研究附子中毒性生物堿烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的肝臟攝取機(jī)制，結(jié)果可為附子及其配伍方劑的研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1儀器 LC-30AD型高效液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadzu公司)，TRIPLE QUAD 5500型質(zhì)譜儀(含Analyst 軟件，美國AB SCIEX)，BT25S型電子天平(德國Sartorius公司，感量：0.01 mg)，Milli-Q型純水儀(美國Millipore公司)，JY 92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，Synergy 4型酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)，12孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)，BHW-05型恒溫加熱平臺(上海博通化學(xué)科技有限公司)。

1.2藥品與試劑 烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿對照品(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，含量：98%)，奧拉帕尼對照品(藥渡經(jīng)緯信息科技有限公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、非必需氨基酸和0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液、青霉素-鏈霉素雙抗液均為Gibco產(chǎn)品。甲醇(色譜純，美國TEDIA公司)，其他試劑與試藥均為分析純，水為去離子水。

1.3色譜條件 Hedera ODS-2 C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，流動相：10 mmol·L-1乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)-甲醇(30：70)，流速：0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量：20 μL。

1.4質(zhì)譜條件 柱后分流0.4 mL·min-1進(jìn)入質(zhì)譜儀，正離子氣動輔助電噴霧離子化(ESI)，離子檢測為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，檢測對象：烏頭堿m/z646.3→586.2，新烏頭堿m/z632.3→572.2，次烏頭堿m/z616.2→556.3，奧拉帕尼(IS)m/z435.2→367.2，噴霧電壓4 kV，溫度500 ℃，碰撞氣68.95 kPa，烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿和內(nèi)標(biāo)的碰撞能分別為46，42，41和28 eV。

1.5溶液的配置 精密稱定烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿各適量，分別加二甲亞砜溶解，并稀釋制成800 μmol·L-1的儲備液；精密移取儲備液適量，用甲醇稀釋制成濃度為1～1000 nmol·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作液。另取奧拉帕尼對照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成0.5 mg·mL-1內(nèi)標(biāo)儲備液；精密移取適量，用甲醇稀釋制成0.5 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)工作液。以上溶液置于-20 ℃冰箱保存。

1.6HepG2細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海藥物研究所饋贈)于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)、相對濕度95%條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液為高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸及1%青霉素-鏈霉素雙抗液)。將細(xì)胞按每孔1×105個(gè)接種到12孔板上，待細(xì)胞長至80%～90%匯合時(shí)進(jìn)行藥物攝取實(shí)驗(yàn)。

1.7細(xì)胞攝取 除另有規(guī)定外，細(xì)胞板置于37 ℃恒溫加熱平臺上，各孔細(xì)胞用37 ℃的Krebs-Henseleit緩沖液(pH值7.4)沖洗2次，并預(yù)孵育30 min，吸干孔內(nèi)溶液，加入含藥緩沖液(烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿各1 μmol·L-1)0.8 mL并開始計(jì)時(shí)，孵育1 min后立即用4 ℃的空白緩沖液快速洗滌3次，吸干孔內(nèi)溶液，細(xì)胞于-80 ℃冰箱保存?zhèn)錅y。考察攝取時(shí)間(0.5，1，2，5 min)、孵育溫度(4，37 ℃)、濃度(1～800 μmol·L-1)、胞外pH值(6.4，7.4，8.4)、胞內(nèi)pH值調(diào)節(jié)(Acute，即攝取實(shí)驗(yàn)時(shí)加入氯化銨；Pre，即預(yù)孵育時(shí)加入氯化銨)、能量抑制劑疊氮化鈉、質(zhì)子泵抑制劑羰基-氰-對-三氟甲氧基苯腙(FCCP)、典型陽離子抑制劑對細(xì)胞攝取的影響。在考察trans-stimulation實(shí)驗(yàn)時(shí)，將細(xì)胞預(yù)先用0.5 mmol·L-1吡拉明或苯海拉明預(yù)孵育，攝取試驗(yàn)時(shí)去除吡拉明和苯海拉明。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組平行操作3次。

其中V為藥物攝取率(nmol·min-1·mg-1)，S為孵育液中藥物濃度(μmol·L-1)，Pdif為被動攝取清除率(mL·min-1·mg-1)，Km為Michaelis-Menten常數(shù)(μmol·L-1)，Vmax為最大攝取率(nmol·min-1·mg-1)。

1.8細(xì)胞樣品處理 各孔加入水 300 μL，超聲裂解細(xì)胞。取細(xì)胞裂解液140 μL，加入內(nèi)標(biāo)工作液20 μL(0.5 μg·mL-1)和甲醇40 μL，渦旋3 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液180 μL進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)(LC-MS/MS)分析。另取BCA試劑盒(Thermo Fisher)定量蛋白。

2 結(jié)果

2.1LC-MS/MS法的建立與驗(yàn)證 空白細(xì)胞裂解液、空白細(xì)胞裂解液加入烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿對照品和內(nèi)標(biāo)，以及實(shí)測樣品的典型LC-MS/MS圖譜見圖1，目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)峰形尖銳，空白細(xì)胞對測定無干擾，方法專屬性良好。以目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值比值f對細(xì)胞裂解液中藥物濃度C進(jìn)行權(quán)重回歸(權(quán)重系數(shù)1/C2)，烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿在0.143～143 nmol·L-1線性關(guān)系良好，典型回歸方程分別為：f=0.039 5C-0.000 7(r=0.997 8)，f=0.045 7C-0.0007(r=0.996 5)，f=0.053 2C-0.000 8(r=0.997 5)。附子生物堿在細(xì)胞裂解液中的最低定量限為0.143 nmol·L-1，完全能滿足藥物攝取實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞樣品的檢測要求。此外，方法的準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性等均符合生物樣品的分析要求。

A.空白細(xì)胞裂解液；B.空白細(xì)胞裂解液加入附子生物堿對照品和內(nèi)標(biāo)；C.藥物攝取實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞樣品

圖1 LC-MS/MS測定HepG2細(xì)胞中附子生物堿的典型色譜圖

A. blank cell lysis buffer; B. cell lysis buffer spiked with references of Fuzi alkaloids and internal standard; C. cell sample in drug uptake test

Fig.1RepresentativeLC-MS/MSchromatogramsofFuzialkaloidsinHepG2cells

2.2HepG2細(xì)胞攝取

2.2.1時(shí)間及溫度依賴性 烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的細(xì)胞攝取量隨著時(shí)間增加而增加。孵育1 min時(shí)，烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿在4 ℃下攝取量僅為37 ℃攝取量的10.0%，11.1%和13.8%(圖2)。

2.2.2濃度依賴性 給予細(xì)胞不同濃度附子生物堿(1～800 μmol·L-1)，附子生物堿的攝取量逐漸增加并趨于飽和(圖3)。藥動學(xué)分析得出烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的米氏常數(shù)Km分別為248.1，69.15，26.89 μmol·L-1，藥物最大攝取率Vmax分別為5.136，2.195，1.139 nmol·min-1·mg-1，Pdif分別為2.58，8.86，2.78 μL·min-1·mg-1。

與37 ℃比較，*1P<0.01

Compared with 37 ℃，*1P<0.01

2.2.3能量依賴性 當(dāng)給予能量抑制劑疊氮化鈉后，3種附子生物堿的攝取量均顯著下降(圖4)。

圖3 孵育液中藥物濃度對附子生物堿在HepG2細(xì)胞中攝取的影響

與對照組比較，*1P<0.01

Compared with control group，*1P<0.01

2.2.4pH依賴性 給予化學(xué)解耦聯(lián)劑FCCP后，附子生物堿的攝取量均顯著下降(圖5)，此外，當(dāng)細(xì)胞處于胞外酸化(pH值6.4)或胞內(nèi)堿化(Acute)時(shí)，烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的攝取量均顯著下降；但當(dāng)胞外堿化(pH值 8.4)或胞內(nèi)酸化(Pre)時(shí)，目標(biāo)物的細(xì)胞攝取量顯著增加(圖6)。

2.2.5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑的影響 不同類型的抑制劑對附子生物堿的細(xì)胞攝取有不同影響(表1)。吡拉明、奎尼丁、維拉帕米、苯海拉明及金剛烷胺可顯著降低附子生物堿的攝取量，而四乙胺、MPP+、乙胺嘧啶及L-肉堿對藥物的攝取量基本沒有影響。

2.2.6Trans-stimulation試驗(yàn) 吡拉明(0.5 mmol·L-1)或苯海拉明(0.5 mmol·L-1)預(yù)孵育細(xì)胞30 min后，移去孔內(nèi)溶液，開始細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的攝取量均顯著增加(圖7)。

3 討論

肝細(xì)胞基底膜上存在多種攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可影響藥物在肝臟中的組織分布，從而影響藥物的藥效與安全性[18]。附子具有肝臟毒性[13]，且烏頭堿和新烏頭堿在人體肝臟中具有較高的組織分布[14]。為指導(dǎo)復(fù)方配伍研究與臨床安全用藥，筆者以HepG2細(xì)胞為體外模型，首次研究了附子毒性生物堿進(jìn)入肝臟的攝取機(jī)制。結(jié)果表明，烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的肝臟攝取均存在溫度依賴性、時(shí)間依賴性和濃度依賴性，并可被能量抑制劑疊氮化鈉抑制，HepG2細(xì)胞對附子生物堿的攝取主要由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)。pH依賴性實(shí)驗(yàn)表明附子生物堿的肝臟攝取依賴于反向的質(zhì)子梯度。由于肝臟的胞內(nèi)pH值為(6.99±0.03)[19]，能夠促進(jìn)附子生物堿攝取進(jìn)入肝臟。

與對照組比較，*1P<0.01

Compared with control group，*1P<0.01

與對照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with control group，*1P<0.01，*2P<0.05

表1 抑制劑對附子生物堿在HepG2細(xì)胞中攝取的影響

化合物濃度/(mmol·L-1)攝取率/%(相對于對照)烏頭堿新烏頭堿次烏頭堿對照組 100 100 100吡拉明111.60±0.73?112.80±0.66?114.60±0.70?1奎尼丁13.98±0.59?14.83±0.85?16.71±0.71?1維拉帕米0.59.92±0.92?111.70±1.10?111.40±1.30?1苯海拉明12.00±1.20?15.24±1.90?16.64±2.20?1金剛烷胺157.10±5.70?155.30±5.30?154.60±6.30?1西咪替丁1116.00±7.30109.00±6.4093.70±4.20四乙胺1104.00±5.3097.90±4.8082.00±3.70MPP+1126.00±13.00116.00±12.00104.00±7.60乙胺嘧啶0.1124.00±12.00123.00±13.0095.40±9.30L-肉堿1122.00±4.10123.00±3.8099.00±3.60

與對照組比較，*1P<0.01

Compared with control group，*1P<0.01

與對照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with control group，*1P<0.01，*2P<0.05

生理?xiàng)l件下附子生物堿主要以陽離子形式存在。目前已知的有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包括有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(organic cation transporters，OCTs)、有機(jī)陽離子/肉毒堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(organic cation/carnitine transporters，OCTNs)、多藥及毒素外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(multidrug and toxin extrusion transporters，MATEs)及質(zhì)膜單胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(plasma membrane monoamine transporter，PMAT)。然而，這些已知轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的典型底物或抑制劑，例如四乙胺(OCTs、OCTNs、MATEs的底物[20-24])、MPP+(OCTs、PMAT和MATE1的底物[25-28])、L-肉堿(OCTN2的底物[29])及乙胺嘧啶(MATEs的抑制劑[30])對細(xì)胞攝取基本沒有影響。近年來，還發(fā)現(xiàn)一種具有全新轉(zhuǎn)運(yùn)特性、吡拉明敏感的有機(jī)陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(pyrilamine-sensitive proton-coupled organic cation antiporter)[17，31-34]，其抑制劑，如吡拉明、苯海拉明、維拉帕米和奎尼丁等可顯著降低烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的細(xì)胞攝取。此外，吡拉明或苯海拉明預(yù)孵育可顯著促進(jìn)細(xì)胞對附子生物堿的攝取，提示這些化合物可能是相同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物。

綜上所述，該新型有機(jī)陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能是附子中主要毒性生物堿進(jìn)入肝臟的分子基礎(chǔ)。臨床上很多藥物是有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的底物或抑制劑[35- 36]，可能會與附子生物堿發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的藥物相互作用，減少其肝組織分布，進(jìn)而增加系統(tǒng)暴露量，發(fā)生毒副作用，臨床上應(yīng)加以關(guān)注。