李 珂，華玉美多，楊占婷，張得鈞，李占強(qiáng)*，樊海寧，蘆殿香***

(1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海-猶他高原醫(yī)學(xué)聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，青海省包蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001)

賽北紫堇(Corydalisimpatiens) 收錄于《中華本草》，藏藥名為“當(dāng)日絲哇”，無(wú)毛一年或兩年生草本，主要分布于青海等地。其為“扎桑”原植物，在藏藥成方中的入藥率高達(dá)25%。國(guó)內(nèi)外對(duì)其毒理學(xué)研究?jī)H停留在大體階段，因此本研究對(duì)賽北紫堇總生物堿進(jìn)行了急性及亞慢性經(jīng)口毒性研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

賽北紫堇購(gòu)于青海中藏藥材市場(chǎng)，由青海大學(xué)張得鈞教授鑒定為Corydalisimpatiens(pall.)Fisch.賽北紫堇。

昆明小鼠：20.0±2 g，150只，雌雄各半，由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(陜)2017-003。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(貨號(hào)：C009-2)、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(貨號(hào)：C010-2)、肌酐試劑盒(貨號(hào)：C011-2-1)、總膽固醇試劑盒(貨號(hào)：A111-1-1)、甘油三酯試劑盒(貨號(hào)：A110-1)、血尿素氮試劑盒(貨號(hào)：C013-1)、白蛋白試劑盒(貨號(hào)：A028-2)購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 賽北紫堇總生物堿制備

取賽北紫堇干燥地上部分30 kg，用85%乙醇閃式提取。乙醇提取液經(jīng)濃縮至無(wú)乙醇味，加稀鹽酸酸化(至pH3)，用石油醚萃取脫脂，萃余相用10%氨水堿化(至pH10)，靜置12 h，取沉淀部位干燥后獲得賽北紫堇總生物堿(648.2g)。

1.2.2 賽北紫堇總生物堿急性毒性試驗(yàn)

根據(jù)我國(guó)《食品安全標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》(GB 15193.3-2014)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用寇氏(Korbor)法研究。以李海麗等[1]測(cè)得的半數(shù)致死量(medianlethaldose，LD50)為參考，選擇的預(yù)實(shí)驗(yàn)劑量分別為350.0、250.0、178.6、127.6、91.0、65.0、46.4、32.8、23.0 mg/kg，對(duì)數(shù)等距。每組4只，雌雄各半，灌胃給藥(僅1次)后觀察14天內(nèi)的反應(yīng)，得到的絕對(duì)致死量(absolute lethal dose，LD100)與最大耐受劑量(maximal tolerance dose，LD0)為最高劑量與最低劑量。

取小鼠60只，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中獲得的最高劑量與最低劑量，將其分為5個(gè)對(duì)數(shù)等距劑量組：100.0、67.0、47.8、29.9、20.0 mg/kg，每組12只，雌雄各半。根據(jù)我國(guó)《食品安全標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》(GB 15193.3-2014)標(biāo)準(zhǔn)中的寇氏法計(jì)算LD50及其可信限。

1.2.3 賽北紫堇總生物堿亞慢性毒性試驗(yàn)

亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)分為4組：空白組，賽北紫堇總生物堿低劑量(5.0mg/kg)、中劑量(10.0mg/kg)、高劑量組(20.0mg/kg)。每組12只，雌雄各半，自由飲食。每日灌胃1次。末次給藥后禁食，但予自由飲水。12 h后于眼球取血，取適量血液于含有肝素鈉的離心管用半自動(dòng)血液生化分析儀進(jìn)行血液生理指標(biāo)分析，用無(wú)肝素鈉離心管中的血液制備血清用于生化指標(biāo)分析。采血后解剖，取小鼠的心、肝、脾、肺、腎，計(jì)算臟器指數(shù)，并用4%多聚甲醛固定，行常規(guī)蘇木素-伊紅(Hematoxylin and Eosin，HE)染色、封片，用顯微鏡觀察結(jié)果并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 賽北紫堇總生物堿急性毒性試驗(yàn)

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得賽北紫堇總生物堿LD100為91.0 mg/kg，LD0為23.4 mg/kg。在正式試驗(yàn)中最高劑量和最低劑量設(shè)為100.0 mg/Kg和20.0 mg/kg。根據(jù)最高劑量和最低劑量對(duì)數(shù)差，設(shè)置5個(gè)對(duì)數(shù)等距的灌胃劑量：100.0、67.0、47.8、29.9、20.0 mg/kg。見(jiàn)表1。

表1 寇式法測(cè)定LD50實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The test result of LD50 determined by Korbor method

表1為寇氏法測(cè)定賽北紫堇總生物堿致死率結(jié)果，并計(jì)算LD50，為42.9 mg/kg，可信限為33.8～54.5。

2.2 賽北紫堇總生物堿對(duì)小鼠的亞慢性毒性試驗(yàn)

2.2.1 賽北紫堇總生物堿對(duì)小鼠體重與臟器指數(shù)的影響

小鼠連續(xù)灌胃給藥28 d后，中劑量組雌鼠體重與空白組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。雌鼠體重明顯低于雄鼠，且高、中、低劑量組的雌鼠與雄鼠之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表2。

表2 賽北紫堇總生物堿對(duì)小鼠體重的影響值Table 2 Effects of total alkaloids of C.impatiens on Murine body

* ：表示與空白組比較差異顯著(P<0.05)，#：表示同一劑量下雌雄之間差異顯著(P<0.05)

小鼠連續(xù)灌胃給藥28 d后，雄鼠中劑量組，雌鼠低、中、高劑量組心臟指數(shù)低于空白組；雄鼠低、高劑量組的肺指數(shù)低于空白組。見(jiàn)表3。

表3 賽北紫堇總生物堿對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響值Table 3 Effects of total alkaloids of C.impatiens on viscera index in

* ：表示與空白組比較差異顯著(P<0.05)

2.2.2 賽北紫堇總生物堿對(duì)小鼠血液學(xué)及生化指標(biāo)的影響

小鼠連續(xù)灌胃給藥28 d后，與空白組相比，藥物組雌鼠的白細(xì)胞數(shù)(WBC)、單核細(xì)胞數(shù)(Mon)、中性粒細(xì)胞值(Neu)、嗜堿性粒細(xì)胞值(Eas)、淋巴細(xì)胞數(shù)(Lym)明顯升高；雌鼠低、高劑量組的嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)值(Eos)升高。雄鼠的Neu、Bas與空白組相比升高；低劑量組Eos與空白組相比升高；低、高劑量組的Lym與空白劑量組相比升高。

雌鼠紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)(RDW-CV)、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差(RDW-SD)與空白組相比明顯升高；低、中劑量組的血小板(PLT)顯著升高。雄鼠RBC、HGB、HCT、RDW-CV、RDW-SD、PLT與空白組相比明顯升高。

雌鼠空白組的WBC、Lym低于雄鼠空白組，而雌鼠低、中劑量組的WBC、Lym高于雄鼠；空白組與藥物組的Mon雌鼠均低于雄鼠；空白組與低劑量組的Neu雌雄小鼠存在差異，雌鼠低于雄鼠，而高劑量組雌鼠高于雄鼠；空白組中雌鼠的Eos高于雄鼠；低劑量組雌鼠的RDW-CV、PLT高于雄鼠；低、高劑量組雌鼠的RDW-SD高于雄鼠。見(jiàn)表4。

表4 賽北紫堇總生物堿對(duì)小鼠血液指標(biāo)的影響值Table 4 Effects of total alkaloids of C.impatienson blood indexes in

續(xù)表：

* ：表示與空白組比較差異顯著(P<0.05)，#：表示同一劑量下雌雄之間差異顯著(P<0.05)

血液生化指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，賽北紫堇總生物堿對(duì)雌鼠的影響較大。雌鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)高于空白組；雌鼠的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)低、中劑量組與空白組有顯著性差異；甘油三酯(TG)中、高劑量組均顯著高于空白劑量組。雄鼠的ALT低、中劑量組均與空白組有顯著性差異，且低、中劑量組均小于空白劑量組；高、低劑量組AST低于空白劑量組；雄鼠3個(gè)劑量組的ALB與空白組比均升高。

雌鼠中、高劑量組尿素氮(BUN)均顯著高于空白劑量組(P<0.05)；雌鼠中、高劑量組比空白組高；肌酐(CRE)高劑量組低于空白組。雄鼠高劑量組的CRE高于空白組。

雌鼠空白組ALT低于雄鼠，而中劑量組雌鼠高于雄鼠；雌鼠空白組與低、中、高劑量組的AST、BUN相比均高于雄鼠。雌鼠的ALB均低于雄鼠；空白組與低劑量組雌鼠的CRE高于雄鼠；雌鼠TG高于雄鼠。

上述數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。

表5 賽北紫堇總生物堿對(duì)血液生化指標(biāo)的影響值Table 5 Effect of total alkaloids of C.impatiens on blood biochemical

續(xù)表：

* ：表示與空白組比較差異顯著(P<0.05)，#：表示同一劑量下雌雄之間差異顯著(P<0.05)

2.2.3 賽北紫堇總生物堿對(duì)小鼠器官組織病理變化的影響

組織病理切片顯示，空白組小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等臟器的組織結(jié)構(gòu)均正常。相對(duì)于空白組，賽北紫堇總生物堿使雌鼠高劑量組心肌間質(zhì)增寬，見(jiàn)圖1。

藥物組血細(xì)胞增多，雌性小鼠的肺泡隔增厚；低劑量組支氣管炎癥細(xì)胞增多；中、高劑量組中可見(jiàn)明顯滲出液及肺泡融合現(xiàn)象，出現(xiàn)炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象。雄性小鼠肺泡隔變薄，出現(xiàn)明顯炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象，且雄鼠中劑量、高劑量組支氣管出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

雌鼠低劑量組肝血竇增多，肝索結(jié)構(gòu)模糊，局部水腫；中、高劑量組肝細(xì)胞核萎縮，產(chǎn)生水腫。雄鼠低、高劑量組肝索模糊，肝細(xì)胞核萎縮，產(chǎn)生水腫，局部有嗜酸性變。雌鼠低劑量組肝索結(jié)構(gòu)模糊較雄鼠嚴(yán)重，水腫現(xiàn)象較雄鼠輕；雌鼠中劑量組核萎縮、水腫現(xiàn)象較雄鼠嚴(yán)重；雄鼠炎癥浸潤(rùn)較雌鼠嚴(yán)重。雌、雄小鼠均有炎癥反應(yīng)。見(jiàn)圖3。

藥物組中，雌鼠的脾臟較為疏松；高劑量組有局部纖維化，炎癥細(xì)胞較多。雄鼠脾臟的紅髓、白髓無(wú)明顯損傷，雄鼠中、高劑量組有輕微炎癥。見(jiàn)圖4。

與空白組對(duì)比，雌鼠3個(gè)劑量組呈現(xiàn)凝固性壞死。雄鼠低劑量組腎小體淡化，邊界模糊，遠(yuǎn)曲小管與近曲小管縮小，中、高劑量組呈現(xiàn)凝固性壞死。雌鼠的腎臟壞死較雄鼠嚴(yán)重。見(jiàn)圖5。

A：空白組；B：低劑量組(5mg/kg)；C：中劑量組(10mg/kg)；D：高劑量組(20mg/kg)圖1 小鼠心臟組織的病理變化圖(HE，×400)Figure 1 Histopathological changes in the heart of mice(HE，×400)

A：空白組；B：低劑量組(5mg/kg)；C：中劑量組(10mg/kg)；D：高劑量組(20mg/kg)

A：空白組；B：低劑量組(5mg/kg)；C：中劑量組(10mg/kg)；D：高劑量組(20mg/kg)

A：空白組；B：低劑量組(5mg/kg)；C：中劑量組(10mg/kg)；D：高劑量組(20mg/kg)

A：空白組；B：低劑量組(5mg/kg)；C：中劑量組(10mg/kg)；D：高劑量組(20mg/kg)

3 討論

本研究結(jié)果顯示，急性小鼠出現(xiàn)中毒表現(xiàn)；亞慢性小鼠肝、腎損傷嚴(yán)重，且雌鼠損傷大于雄鼠。本研究測(cè)得的LD50與李海麗等[1]測(cè)得的LD50有一定差異，可能與提取方法有關(guān)。

對(duì)小鼠的亞慢性毒性研究數(shù)據(jù)表明：賽北紫堇總生物堿對(duì)雌鼠體重的增長(zhǎng)具有抑制作用，且給藥組雌性小鼠體重較雄鼠低。對(duì)小鼠的心、肝、脾、腎的臟器指數(shù)無(wú)顯著性影響，雄性小鼠低、高劑量組肺組織指數(shù)降低。根據(jù)血液生理指標(biāo)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)賽北紫堇總生物堿對(duì)雌鼠的WBC、Neu、Lym、Mon、Eas影響明顯(升高)，可能存在炎癥反應(yīng)與水腫。與HE切片相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)雌鼠肺、肝、脾、腎臟炎性細(xì)胞增多，具有炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象。雌鼠RBC、HGB、HCT、RDW-CV、RDW-SD升高，可能與小鼠缺氧或肺部炎癥有關(guān)。雄鼠Neu、Bas、RBC、HCT、RDW-CV、RDW-SD升高，可能存在炎癥浸潤(rùn)。通過(guò)血清生化指標(biāo)進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)AST、ALT、BUN、CRE、ALB、TG均有變化，雌鼠中、高劑量的ALT、TG有明顯升高，低、中劑量組的AST升高，可能會(huì)增加肝臟負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致肝臟損傷[2]。雄鼠低、中劑量的ALT，低、高劑量組的AST降低，可能是肝臟存在炎癥所致[3]。雌、雄鼠各個(gè)組之間均有差異，而不同性別的ALT、AST空白組指標(biāo)存在明顯差異，與血液生理學(xué)指標(biāo)結(jié)合，顯示賽北紫堇總生物堿對(duì)小鼠肝臟具有損傷性。雄鼠ALB升高與小鼠肝臟損傷有關(guān)。雌鼠中、高劑量組的BUN顯著升高，高劑量組的CRE降低與腎功能有關(guān)；病理切片觀察結(jié)合上述指標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肺、肝、脾組織存在炎癥反應(yīng)；雌性肝、腎小鼠炎癥浸潤(rùn)較雄鼠嚴(yán)重。小鼠腎小體結(jié)構(gòu)淡化或消失，有局部壞死；雌鼠腎臟凝固性壞死較雄鼠嚴(yán)重。上述結(jié)果顯示賽北紫堇總生物堿對(duì)小鼠的腎臟、肝臟損傷較為明顯。

賽北紫堇中含有大量異喹啉類生物堿，已報(bào)道23個(gè)，niuxiaofeng等對(duì)其中11種生物堿含量進(jìn)行了測(cè)定，其中bicuculine與protopine較高，為賽北紫堇總生物堿的總成分，且發(fā)現(xiàn)藏地不同區(qū)域的塞北紫堇總生物堿主成分存在差異[4-5]。國(guó)內(nèi)外對(duì)賽北紫堇總生物堿與其生物堿類成分的毒理學(xué)研究極少，因此在后續(xù)研究過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步明確主要毒性物質(zhì)，為藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供可靠依據(jù)。

綜上所述，賽北紫堇總生物堿對(duì)雌雄小鼠的影響存在性別差異(雌鼠損傷大于雄鼠)；急慢性方面：急性小鼠出現(xiàn)中毒表現(xiàn)；亞慢性小鼠肝、腎損傷嚴(yán)重。