蔣巧燕，張 穎，胡繽文，湯 鋒#，李潤樂&

(1.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，高原醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001)

棘球蚴病分為泡型包蟲病(alveolar echinococcosis，AE)、囊型包蟲病(cystic echinococcosis，CE)，分別由多房棘球蚴(E.m.)、細(xì)粒棘球蚴(E.g.)感染引起[1]，由于形態(tài)學(xué)觀察很難區(qū)分絳蟲屬蟲卵，目前疾控?zé)o法準(zhǔn)確區(qū)分不同環(huán)境中的棘球絳蟲污染源[2]，因此需建立起一種對多房/細(xì)粒棘球蚴分型的快速檢測方法。2000年，Notomi[3]等創(chuàng)建了一種在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增的新技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)，由于該技術(shù)具有快速、精確、高敏感性及等溫?cái)U(kuò)增和無需專門儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，近年來，被廣泛應(yīng)用于病原微生物的快速檢測。

線粒體DNA具有母系遺傳、缺乏重組和進(jìn)化速率高等特點(diǎn)，是研究物種進(jìn)化與區(qū)分物種的一個(gè)很有用的遺傳標(biāo)記[4]，NADH脫氫酶第二亞基(ND2)作為線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體的關(guān)鍵組分與線粒體其他蛋白質(zhì)編碼基因和rRNA相比具有更快的進(jìn)化速率[5]，許多學(xué)者已經(jīng)將ND2基因序列應(yīng)用于生物分子系統(tǒng)學(xué)的研究[6]。本實(shí)驗(yàn)利用生物信息學(xué)軟件Primerexplorer，針對多房/細(xì)粒棘球蚴線粒體基因組ND2基因，設(shè)計(jì)出可用于區(qū)分多房和細(xì)粒棘球蚴DNA樣本的LAMP引物，建立起一種快速分型方法。

1 材料與方法

1.1 材料

DNA提取試劑盒購自Tiangen生化科技(北京)有限公司，dNTP(10mM each)購自Tiangen生化科技(北京)有限公司，Bst DNA聚合酶購自BioLabs公司。多房棘球蚴和細(xì)粒棘球蚴DNA為青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心保存品。

1.2 方法

1.2.1 LAMP引物設(shè)計(jì)

在NCBI基因庫中，針對多房棘球蚴線粒體基因組序列(登錄號：NC 000928.2)和細(xì)粒棘球蚴線粒體基因組序列(登錄號：AF297617.1)，利用生物信息學(xué)軟件primerexplorer設(shè)計(jì)出兩組LAMP引物(表1)。引物由上海生工公司合成。

1.2.2 DNA提取及檢測

使用DNA提取試劑盒提取樣本DNA進(jìn)行濃度檢測。稀釋到試驗(yàn)所需濃度(2ng/μL)后通過電泳檢測DNA提取質(zhì)量。

1.2.3 反應(yīng)液配置

按要求配制25 μL反應(yīng)液[10×Thermo Pol Buffer(2.5μL)；MgSO4(100mM，1.5μL)；dNTP Mix(10mM，3.5μL)；FIP(40μmol/L，1.0μL)；BIP(40μmol/L，1.0μL)；F3(5μmol/L，1.0μL)；B3(5μmol/L，1.0μL)；Bst DNA polymerase(8000U/mL，1.0μL)；LAMP可見光染料(1.25μL)；模板(2.0μL)；ddH2O(9.25 μL)]。

1.2.4 LAMP擴(kuò)增條件設(shè)定

65 ℃下擴(kuò)增60 min，82 ℃下延伸10 min。

1.2.5 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物檢驗(yàn)

擴(kuò)增產(chǎn)物可直接通過觀察LAMP可見光染料顏色變化得出結(jié)果(陽性結(jié)果顏色由反應(yīng)前的紫色變成天藍(lán)色，仍為紫色則是陰性)后吸取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物行2%凝膠電泳檢測驗(yàn)證(陽性結(jié)果為階梯條帶，否則為陰性)。

1.2.6 引物篩選

在多組引物中找出一組多房/細(xì)粒棘球蚴分型檢測結(jié)果最佳的，針對其所對應(yīng)的線粒體基因，再設(shè)計(jì)一組該基因的引物進(jìn)行驗(yàn)證，從中選擇檢測效果最佳的引物組。

表1 ND2基因的LAMP引物序列Table 1 Primers used for ND2 gene

1.2.7 反應(yīng)溫度優(yōu)化

使用1.2.6中最優(yōu)引物組尋找其最適反應(yīng)溫度。以61 ℃～65 ℃為待選范圍，選出引物的最適反應(yīng)溫度。

1.2.8 Mg2+反應(yīng)濃度優(yōu)化

使用1.2.6中最優(yōu)引物組尋找其最適Mg2+反應(yīng)濃度。以1.3～1.7×10-4mM為待選范圍、0.1×10-4mM為梯度重復(fù)試驗(yàn)濃度選出引物的最適Mg2+反應(yīng)濃度。

1.2.9 dNTP Mix反應(yīng)濃度優(yōu)化

使用1.2.6中最優(yōu)引物組尋找其最適dNTP Mix反應(yīng)濃度。以3.3～3.7×10-5mM為待選范圍、0.1×10-5mM為梯度重復(fù)試驗(yàn)濃度選出引物的最適dNTP Mix反應(yīng)濃度。

2 結(jié)果

2.1 ND2基因LAMP引物序列及位點(diǎn)圖的篩選

通過BLAST差異比對從多房和細(xì)粒棘球蚴線粒體ND2基因篩選出差異序列(圖1)，并在此基礎(chǔ)之上采用生物信息學(xué)軟件primerexplorer，針對線粒體基因組中ND2差異序列設(shè)計(jì)出了兩組用于區(qū)分多房和細(xì)粒棘球蚴的LAMP引物ND2A、ND2B序列及位點(diǎn)圖(圖1)。

A：ND2A(E.m.)的靶序列位點(diǎn)圖；B：ND2A(E.g.)的靶序列位點(diǎn)圖；C：ND2B(E.m.)的靶序列位點(diǎn)圖；D：ND2B(E.g.)的靶序列位點(diǎn)圖A：target sequence of ND2A(E.m.)；B：target sequence of ND2A(E.g.)；C：target sequence of ND2B(E.m.)；D：target sequence of ND2B(E.g.)圖1 ND2基因LAMP引物靶序列位點(diǎn)圖Figure 1 Targets sequences of primers for LAMP of ND2 gene

2.2 多房棘球蚴和細(xì)粒棘球蚴的DNA提取

分別從實(shí)驗(yàn)室保存的多房棘球蚴原頭節(jié)和細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)中提取多房棘球蚴和細(xì)粒棘球蚴DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測確認(rèn)其質(zhì)量符合后續(xù)LAMP實(shí)驗(yàn)要求(可用于LAMP擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，圖2)

1：DL2000 DNA marker；2：多房棘球蚴DNA；3：細(xì)粒棘球蚴DNA1：DL2000 DNA marker；2：DNA of Echinococcus multilocularis；3：DNA of Echinococcus granulosus圖2 DNA1%瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 2 Bands of DNA samples by 1% agarose gel electrophoresis

2.3 LAMP分型檢測引物的篩選及驗(yàn)證

分別以多房棘球蚴DNA、細(xì)粒棘球蚴DNA、超純水、人源基因組DNA為模板，以設(shè)計(jì)獲得的ND2A(E.m.)、ND2A(E.g.)、ND2B(E.m.)、ND2B(E.g.)為引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，之后通過瓊脂糖凝膠電泳及可視化探針對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行評價(jià)(圖3、4)：ND2A(E.m.)可準(zhǔn)確擴(kuò)增出多房棘球蚴目的序列而無法以細(xì)粒棘球蚴DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，ND2A(E.g.)可準(zhǔn)確擴(kuò)增出細(xì)粒棘球蚴目的序列而無法以多房棘球蚴DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，ND2B(E.m.)可準(zhǔn)確擴(kuò)增出多房棘球蚴目的序列而無法以細(xì)粒棘球蚴DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增效率較低，可視化探針無法檢測到；ND2B(E.g.)對多房棘球蚴DNA及細(xì)粒棘球蚴DNA均可擴(kuò)增。ND2A這組引物可用于多房和細(xì)粒棘球蚴的分型檢測，而ND2B組引物無法準(zhǔn)確區(qū)分多房和細(xì)粒棘球蚴DNA樣本。

A：ND2A(E.m.)；B：ND2A(E.g.)；C：ND2B(E.m.)；D：ND2B(E.g.)1：DL2000 DNA marker；2：多房棘球蚴DNA；3：細(xì)粒棘球蚴DNA；4：超純水；5：正常人的組織DNAA：ND2A(E.m.)；B：ND2A(E.g.)；C：ND2B(E.m.)；D：ND2B(E.g.)1：DL2000 DNA marker；2：DNA of Echinococcus multilocularis；3：DNA of Echinococcus granulosus；4：ultrapure water；5：DNA of normal human tissue圖3 ND2A引物和ND2B引物擴(kuò)增結(jié)果的2%瓊脂糖電泳圖Figure 3 Results of ND2A and ND2B probes in 2% agarose gel electrophoresis

A：ND2A(E.m.)；B：ND2A(E.g.)；C：ND2B(E.m.)；D：ND2B(E.g.)1～4加入的模板順序?yàn)椋憾喾考蝌蔇NA；細(xì)粒棘球蚴DNA；超純水；正常人的組織DNAA：ND2A(E.m.)；B：ND2A(E.g.)；C：ND2B(E.m.)；D：ND2B(E.g.)The order of the templates added to 1～4 is： DNA of Echinococcus multilocularis；DNA of Echinococcus granulosus；ultrapure water；DNA of normal human tissue

2.4 ND2A引物的反應(yīng)溫度的優(yōu)化

ND2A引物以61 ℃～65 ℃為待選范圍選出該組引物的最適反應(yīng)溫度。如圖5所示，ND2A(E.m.)引物擴(kuò)增效率自61 ℃到65 ℃呈先增加后減少的趨勢，故將ND2A(E.m.)的引物最適反應(yīng)溫度定為64 ℃，而ND2A(E.g.)引物擴(kuò)增效率自61 ℃到65 ℃呈逐步降低的趨勢，故將ND2A(E.g.)引物的最適反應(yīng)溫度定為61 ℃。

A：ND2A(E.m.)；B：ND2A(E.g.).1：DL2000 DNA marker，2～6：61℃～65℃圖5 ND2A引物最適反應(yīng)溫度的2%瓊脂糖電泳圖Figure 5 Optimum reactive temperature of ND2A probe in 2% agarose gel electrophoresis

2.5 ND2A引物的Mg2+反應(yīng)濃度的優(yōu)化

ND2A引物以1.3～1.7×10-4mM為待選范圍、0.1×10-4mM為梯度重復(fù)試驗(yàn)濃度選出引物的最適Mg2+反應(yīng)濃度。ND2A(E.m.)這一引物最適Mg2+反應(yīng)濃度為1.5×10-4mM，ND2A(E.g.)這一引物最適Mg2+反應(yīng)濃度為1.7×10-4mM(圖6)

A：ND2A(E.m.)；B：ND2A(E.g.).1：DL2000 DNA marker，2～6：1.3～1.7×10-4mM圖6 ND2A引物最適Mg2+反應(yīng)濃度的2%瓊脂糖電泳圖Figure 6 Optimum Mg2+ reactive concen trationin ND2A probe by 2% agarose gel electrophoresis

A：ND2A(E.m.)；B：ND2A(E.g.).1：DL2000 DNA marker，2～6：3.3～3.7×10-5mM

2.6 ND2A引物的dNTP Mix反應(yīng)濃度的優(yōu)化

ND2A引物以3.3～3.7×10-5mM為待選范圍、0.1×10-5mM為梯度重復(fù)試驗(yàn)濃度選出引物的最適dNTP Mix反應(yīng)濃度。ND2A(E.m.)這一引物最適dNTP Mix反應(yīng)濃度為3.4×10-5mM，ND2A(E.g.)這一引物最適dNTP Mix反應(yīng)濃度為3.5×10-5mM(圖7)。

3 討論

自2013年以來，國內(nèi)外的研究團(tuán)隊(duì)完成了對多房棘球蚴[7]和細(xì)粒棘球蚴[8]的全基因組測序，這為棘球蚴的防治奠定了重要基礎(chǔ)?，F(xiàn)階段已將PCR技術(shù)運(yùn)用于棘球蚴的檢測[9]，PCR擴(kuò)增具有精確敏感快速等優(yōu)點(diǎn)，但需要熟練操縱技能的人才和昂貴的儀器(熱循環(huán)儀器)才能完成，造成該技術(shù)使用受到限制。而LAMP不但具有PCR的精確敏感快速等優(yōu)點(diǎn)，還具備反應(yīng)條件簡單便于直接觀察等彌補(bǔ)了PCR在基層不便于大規(guī)模應(yīng)用的缺點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于病原體的診斷和鑒別診斷：張偉陽[10]等研究發(fā)現(xiàn)LAMP可用于診斷結(jié)核分支桿菌；許靜[11]等研究發(fā)現(xiàn)LAMP可用于早期檢測日本血吸蟲感染家兔血清的特異性DNA；張超群[12]等研究發(fā)現(xiàn)LAMP可用于幽門螺旋桿菌檢測及分型研究；王岑[13]等研究發(fā)現(xiàn)LAMP可用于診斷日本血吸蟲的DNA。

Mohamed E[14]于2016年報(bào)道了實(shí)時(shí)LAMP法用于鑒定細(xì)粒棘球蚴G5和G6分型檢測、Salant H[15]于2012年報(bào)道了LAMP法用于細(xì)粒棘球蚴病原體的檢測、Ni X[16]于2014年報(bào)道了LAMP法用于多房棘球蚴終末宿主腸道內(nèi)病原體及糞便中蟲卵的檢測，然而上述三項(xiàng)檢測方法不能同時(shí)對多房棘球蚴與細(xì)粒棘球蚴進(jìn)行分型檢測。由于我國青海省三江源地區(qū)和四川省石渠縣等流行區(qū)屬于多房棘球蚴和細(xì)粒棘球蚴的混合感染區(qū)[17]，需要能夠準(zhǔn)確區(qū)分兩種病原體的分子生物學(xué)方法，本研究旨在建立一種可以有效區(qū)分細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴病原體的LAMP反應(yīng)體系。

本研究進(jìn)行了多房棘球蚴和細(xì)粒棘球蚴基因組的全序列對比，結(jié)果顯示這兩者的全基因組序列存在極大相似性，不利于分型檢測。由于多房棘球蚴和細(xì)粒棘球蚴線粒體序列相似性在95%以上，故通過常規(guī)的引物設(shè)計(jì)較難區(qū)分二者。本研究首先通過序列比對選擇了多房棘球蚴與細(xì)粒棘球蚴線粒體基因組中ND2基因中差異較大的序列，通過生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)了兩組用于區(qū)分?jǐn)U增二者的LAMP引物，經(jīng)后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證獲得了ND2A(E.m.)和ND2A(E.g.)用于有效區(qū)分二者，而ND2B(E.m.)和ND2B(E.g.)由于擴(kuò)增效率、擴(kuò)增特異性等原因無法有效區(qū)分。

LAMP擴(kuò)增結(jié)果的檢測方法有多種：2%瓊脂糖凝膠電泳檢測法靈敏度高，但存在一定的缺點(diǎn)，如易造成污染引起假陽性結(jié)果且需要電泳儀等；目視渾濁法(陽性LAMP擴(kuò)增結(jié)果會(huì)產(chǎn)生沉淀：dNTPs在Bst酶的作用下會(huì)產(chǎn)生PPi，PPi=P2O7，P2O74-和Mg2+作用會(huì)產(chǎn)生Mg2P2O7，Mg2P2O7是一種白色沉淀物，會(huì)使陽性擴(kuò)增管產(chǎn)生渾濁)需要有經(jīng)驗(yàn)的檢測人員才能準(zhǔn)確判斷；反應(yīng)前、后加入染料觀測法(擴(kuò)增前后顏色的不同)優(yōu)于上述方法。

反應(yīng)前、后加入染料觀測法最初采用SYBR greenⅠ，但因其不能特異性指示LAMP產(chǎn)物，并且在反應(yīng)前加入會(huì)抑制反應(yīng)的進(jìn)行；需要在反應(yīng)之后開蓋加入，易造成污染引起假陽性結(jié)果。之后采用鈣黃綠素，但鈣黃綠素需要和錳離子進(jìn)行一定比例的配比才能達(dá)到檢測目的，且較不穩(wěn)定。最后采用的是生物公司制備的LAMP可見光染料，陽性擴(kuò)增結(jié)果會(huì)從原先的紫色變成天藍(lán)色，肉眼便可斷定結(jié)果，且該染料在反應(yīng)前便加入反應(yīng)體系中，既不會(huì)抑制反應(yīng)進(jìn)行也不需要開蓋加入而造成污染引起假陽性結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)最終篩選出的ND2A引物，是針對多房棘球蚴和細(xì)粒棘球蚴線粒體基因組中的ND2基因設(shè)計(jì)的，其BLAST結(jié)果顯示為沒有明顯的相似性，為多房/細(xì)粒棘球蚴的分型檢測提供了有效方法。利用LAMP采用ND2A引物這一體系，初步建立起了一種多房/細(xì)粒棘球蚴分型的快速檢測方法，并進(jìn)行了反應(yīng)溫度的優(yōu)化：ND2A(E.m.)的最適溫度為64 ℃，ND2A(E.g.)的最適溫度為61 ℃。上述工作將為后續(xù)應(yīng)用于不同環(huán)境棘球絳蟲污染源的檢測奠定了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究通過多房棘球絳蟲與細(xì)粒棘球絳蟲線粒體ND2基因設(shè)計(jì)，篩選獲得可用于分型鑒別多房/細(xì)粒棘球蚴的LAMP引物的方法，并進(jìn)一步通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了一種基于LAMP技術(shù)用于多房/細(xì)粒棘球蚴分型檢測的分子生物學(xué)方法。