鄭 佳，李占強(qiáng)，楊全余，廖夢姣，張 穎，胡繽文，湯 鋒#，李潤樂&

(1.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，高原醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；3.青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810001；4.遵義第五附屬醫(yī)院，貴州 遵義 536000)

目前治療包蟲病的臨床藥物主要是阿苯達(dá)唑。近年來，我們在中藥中發(fā)現(xiàn)石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)具有殺傷棘球蚴作用，本研究意圖尋找其產(chǎn)生作用的單體化合物。

α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚是石菖蒲根莖中的有效成分[1]。有文獻(xiàn)顯示菖蒲屬金錢蒲的己烷提取物，具有殺蟲活性，活性成分為α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚。本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)對比α-細(xì)辛醚和β細(xì)辛醚對多房棘球蚴的殺傷效果，并對不同劑量殺傷效果進(jìn)行檢測，初步明確細(xì)辛醚對多房棘球蚴的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青霉素-鏈霉素混合溶液(Solarbio)，α-細(xì)辛醚(成都埃法生物公司，純度>98%)，β-細(xì)辛醚(成都埃法生物公司，純度>98%)，阿苯達(dá)唑(梯希愛公司，純度>98%)。

BB15型培養(yǎng)箱(Thermo公司)，Axio Vert.A1型光學(xué)顯微鏡(Carl Zeiss Jena公司)。

1.2 方法

1.2.1 α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚藥物作用效果檢測

多房棘球蚴的分離及體外培養(yǎng)方法詳見本課題組前期研究報(bào)道[2，3]。α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚分別用DMEM培養(yǎng)基稀釋至5 mg/mL，將2 mL藥物稀釋液分別加入到含有1 000個(gè)原頭蚴的6孔板中，每組三個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)箱中(5% CO2，37℃)培養(yǎng)30 min。將阿苯達(dá)唑用DMEM培養(yǎng)基稀釋至5 mg/mL，作藥物對照。

1.2.2 β細(xì)辛醚不同濃度作用效果檢測

1.2.3 原頭蚴表面結(jié)構(gòu)變化觀察

將藥物作用后的多房棘球蚴采用掃描電鏡樣本制備的方法[4]處理后觀察其表面結(jié)構(gòu)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，多重兩兩比較使用Dunnett-t檢驗(yàn)或LSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚對多房棘球蚴殺傷作用的藥效學(xué)評價(jià)

將濃度為5 mg/mL的α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚、阿苯達(dá)唑在培養(yǎng)基與多房棘球蚴共培養(yǎng)30 min。每孔吸出10 μL用伊紅染色，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)5 mg/mL β-細(xì)辛醚組內(nèi)多房棘球蚴被伊紅染色，如圖1A所示。5 mg/mLβ-細(xì)辛醚、阿苯達(dá)唑組內(nèi)多房棘球蚴未被染色，如圖1B、C所示。空白對照組多房棘球蚴沒有被伊紅染色。

2.2 不同劑量β-細(xì)辛醚對多房棘球蚴殺傷作用的評價(jià)

將濃度分別為5.00、2.50、1.25、0.75 mg/mL的β-細(xì)辛醚與多房棘球蚴共培養(yǎng)，分別在0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0 h時(shí)吸取10 μL多房棘球蚴溶液，染色發(fā)現(xiàn)5 mg/mL和2.5 mg/mL的β-細(xì)辛醚分別在0.5 h和2 h時(shí)，全部被伊紅染色。與濃度為1.25 mg/mL、0.75 mg/mL的β-細(xì)辛醚分別作用20 h后，死亡率分別為(98.9±0.4933)%和(64.33±2.333)%，如圖2所示。

2.3 對β-細(xì)辛醚作用后的多房棘球蚴的表面結(jié)構(gòu)觀察

與2.5 mg/mL β-細(xì)辛醚作用2 h后的多房棘球蚴立刻用3%戊二醛固定。用掃描電鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示空白對照組多房棘球蚴體表完整，原頭蚴形態(tài)正常，圖3白色箭頭所示頭部微絨毛豐富且整齊，而藥物作用后多房棘球蚴體表凹凸不平，頭部無微絨毛且形態(tài)不完整，鉤疑似已脫落。

A：β-細(xì)辛醚；B：α-細(xì)辛醚；C：阿苯達(dá)唑；D：空白對照圖1 α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚對多房棘球蚴的殺傷作用圖Figure 1 The effect of α-asarone and β-asarone on protoscoleces

A：0.75 mg/mL β-細(xì)辛醚作用20 h；B：1.25 mg/mL β-細(xì)辛醚作用20 h；

A 空白對照；B β-細(xì)辛醚

3 討論

石菖蒲揮發(fā)油中細(xì)辛醚類為主要的活性成分，其中α-細(xì)辛醚占0.3%、β-細(xì)辛醚占0.7%[5]。本研究顯示β-細(xì)辛醚具有很好殺滅多房棘球蚴的作用。

很多藥物的活性與其空間結(jié)構(gòu)有密切的關(guān)系，藥物的不同立體結(jié)構(gòu)會影響藥物活性[6]，在很多藥物順反異構(gòu)體中只有其中一種具有藥物活性，比如乙烯雌酚、維生素A、頭孢噻肟鈉、亞油酸、花生四烯酸、順鉑等。α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚是順反異構(gòu)體，α-細(xì)辛醚為(E)-1，2，4-三甲氧基-5-丙烯基苯，β-細(xì)辛醚是(Z)-1，2，4-三甲氧基-5-丙烯基苯。本研究發(fā)現(xiàn)只有β-細(xì)辛醚對多房棘球蚴具有殺傷作用，α-細(xì)辛醚隨時(shí)間推移對多房棘球蚴無任何殺傷作用，因此這兩種藥物的甲氧基和丙烯基的空間位置結(jié)構(gòu)可能影響了對多房棘球蚴的殺傷作用。一般來說反式結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，順式結(jié)構(gòu)在一定情況會向反式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[7，8]，本文結(jié)果中β-細(xì)辛醚具有針對多房棘球蚴的殺傷作用，在該藥物的應(yīng)用中應(yīng)考慮到該藥物空間結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定容易發(fā)生改變的情況，制劑時(shí)應(yīng)添加穩(wěn)定劑等。

有研究表明，β-細(xì)辛醚可降低癲癇小鼠腦皮質(zhì)GAD65的表達(dá)及Glu、GABA的含量，且呈明顯的量效關(guān)系，50 mg/kg/d組與基質(zhì)對照組不具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[9]。朱彩霞等[10]研究發(fā)現(xiàn)β-細(xì)辛醚15、30 mg/kg組可顯著增加抑郁小鼠腦、紋狀體中5-HT、5-HIAA的含量，7.5 mg/kg組差異不顯著。因此β-細(xì)辛醚的濃度對其藥效有影響。本研究在確定β-細(xì)辛醚具有殺傷作用后，又進(jìn)一步對其不同劑量作用時(shí)間進(jìn)行評價(jià)，發(fā)現(xiàn)β細(xì)辛醚在5 mg/mL時(shí)可在0.5 h內(nèi)殺滅所有多房棘球蚴，隨濃度的降低完全殺滅的時(shí)間變長，顯示濃度對多房棘球蚴殺傷效果有影響。

本研究僅說明β-細(xì)辛醚在體外對多房棘球蚴具有較好的殺傷作用。但在體內(nèi)其是否具有相同作用有待進(jìn)一步確認(rèn)。