王野影， 粟海軍， 熊 勇， 張明明

(1. 貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物生理與發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽 550025; 2. 貴州大學(xué) 生物多樣性與自然保護(hù)研究中心, 貴陽 550025)

夜鷺(Nycticoraxnycticorax)隸屬于鵜形目(Pelecaniformes)鷺科(Ardeidae)夜鷺屬(Nycticorax)。依據(jù)IOC World Bird List (v 7.3)提供的數(shù)據(jù)，夜鷺屬曾經(jīng)包含6個(gè)種，目前4個(gè)狹域分布種已滅絕，僅剩存兩個(gè)廣布種夜鷺和棕夜鷺(Nycticoraxcaledonicus)。其中夜鷺在除澳大利亞外的全球各區(qū)域均有分布(https://www.hbw.com/species/black-crowned-night-heron-nycticorax-nycticorax)，種下分為4個(gè)亞種，分別為夜鷺?？颂m群島亞種(Nycticoraxnycticoraxfalklandicus)，主要分布在?？颂m群島；夜鷺美洲亞種(Nycticoraxnycticoraxhoactli)，主要分布在加拿大南部到阿根廷北部，智利和夏威夷；夜鷺指名亞種(Nycticoraxnycticoraxnycticorax)，主要分布在歐亞大陸南部到印度尼西亞和非洲；夜鷺火地島亞種(Nycticoraxnycticoraxobscurus)，主要分布在智利和阿根廷西南部。由于其全球分布，又存在物種分化，亞種形成的現(xiàn)象，所以作者認(rèn)為其是探討物種分化原因的一個(gè)理想物種。

近年來，關(guān)于夜鷺的研究集中在多個(gè)領(lǐng)域，如夜鷺的越冬生態(tài)、繁殖生態(tài)研究[1-2]、巢址選擇[3]、遷徙行為[4]等。因夜鷺和夜鷺卵可富集重金屬，被認(rèn)為是良好的生態(tài)指示種[5]，目前針對夜鷺或者卵的重金屬富集特征已開展多項(xiàng)研究[6-7]。國外有學(xué)者致力于研究夜鷺的免疫和生殖健康評價(jià)[8]。但關(guān)于夜鷺的系統(tǒng)發(fā)育位置及譜系地理學(xué)研究較少，且目前所有研究均未涉及有關(guān)夜鷺物種分化問題的探討。

線粒體基因數(shù)據(jù)是研究鳥類進(jìn)化的主要數(shù)據(jù)來源[9]。線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I (Cytochrome c oxidase I，COX1)基因由于具備蛋白編碼基因所共有的特點(diǎn)，即密碼子第3位堿基不受自然選擇壓力的影響可以自由變異；又因自身攜帶足夠的變異位點(diǎn)，且容易被擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于物種界定和親緣關(guān)系分析中。本文以來自貴州草海的夜鷺的COX1基因結(jié)合從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的夜鷺的COX1基因序列，采用分子系統(tǒng)發(fā)育和分歧年代評估相結(jié)合的方法，對夜鷺的分化問題進(jìn)行探討。目的是從分子水平上揭示夜鷺的分化原因，為后續(xù)研究全球分布種的物種分化問題奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用實(shí)驗(yàn)材料為作者于2016年12月，在貴州省草海國家級自然保護(hù)區(qū)獲得的不明原因死亡夜鷺指名亞種一只(由于空間有限，在下文中的表1及圖3中僅標(biāo)識為Ny.nycticorax)，取頸后部肌肉組織約0.5 g，浸泡在無水乙醇中，帶回實(shí)驗(yàn)室，-4℃冰箱保存直至提取其DNA。另外包含從GenBank上下載的來自不同國家的19只夜鷺、4只白鷺屬鳥類及4只朱鹮的COX1序列。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用SDS法進(jìn)行DNA提取[10]，從所取得夜鷺肌肉組織中提取總DNA，提取出的DNA加入100 μL無菌水溶解，于-20℃冰箱保存。

1.2.2COX1基因擴(kuò)增及測序

用于擴(kuò)增夜鷺COX1基因的引物、反應(yīng)體系及反應(yīng)程序均參考Folmer等的研究[11]，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增的COX1基因片段長度約為650 bp，1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，條帶單一且位于D2000 DNA Marker(天根生化科技有限公司)中的500～750 bp條帶之間，則直接送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序采用Sanger法。

1.2.3COX1基因的飽和性分析

使用DAMBE5.2.30軟件[12]進(jìn)行COX1基因第3位堿基的替換飽和分析，結(jié)果如圖1。當(dāng)F84距離為1.9363時(shí)，Ts和Tv相等，隨后曲線有下降趨勢，并未呈現(xiàn)線性關(guān)系，出現(xiàn)了飽和現(xiàn)象，因此，在后續(xù)的分析中，均去除第3位密碼子。

圖1 夜鷺COX1基因第三位堿基的替換飽和性分析

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測得的夜鷺COX1基因序列整理成Fasta格式，進(jìn)入NCBI Blast網(wǎng)站進(jìn)行序列比對。確保所獲序列來自夜鷺，同時(shí)下載GenBank上已有的夜鷺COX1基因序列以及外群序列，外群序列參考Zhou等的研究[13]，選用與夜鷺屬鳥類親緣關(guān)系較近的白鷺屬(Egretta)部分鳥類作為外群，進(jìn)行后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)育分析所有序列整理成一個(gè)Fasta文件，序列詳細(xì)信息詳見表1。

使用EMBL-EBI的在線工具M(jìn)USCLE online(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)程序?qū)φ淼腇asta文件中共24條序列進(jìn)行多重比對。使用Jmodeltext[22]軟件對比對好的文件進(jìn)行模型計(jì)算，獲得用于系統(tǒng)發(fā)育分析的最優(yōu)模型為GTR+I+G。使用MEGA7[23]和MrBayes 3.2.1 (http://mrbayes.sourceforge.net/download.php)軟件，分別采用NJ (Neighbor-Joining)法和貝葉斯法(Bayes)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。構(gòu)建NJ樹時(shí)選擇GTR模型，1000次重復(fù)。BI樹計(jì)算時(shí)，使用4個(gè)馬爾科夫鏈，同時(shí)進(jìn)行兩次獨(dú)立的runs，起始樹設(shè)為隨機(jī)，共計(jì)運(yùn)行1000萬代，將起始的250萬代系統(tǒng)樹(25%)作為burn-in刪除。運(yùn)行1000萬代后，兩個(gè)獨(dú)立分析的相似度已小于0.01，結(jié)束運(yùn)算。由于貝葉斯法計(jì)算時(shí)只能選擇一個(gè)外群，所以本研究僅用Genbank登錄號為GQ481726的白鷺屬的一個(gè)物種，作為外群。使用Figtree v1.4 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)進(jìn)行進(jìn)化樹的查看。Adobe Illustrator CS4進(jìn)行兩種方法構(gòu)建的進(jìn)化樹的編輯和整合。

表1 本研究所使用的夜鷺線粒體COX1基因信息

注：序列來源中無參考文獻(xiàn)部分表明，序列來自NCBI，但相關(guān)文章未發(fā)表

1.2.5 分歧年代評估

使用BEAST v1.6.1軟件[24]進(jìn)行夜鷺分化時(shí)間的估算，由于鳥類化石比較少，沒有選用到合適的化石進(jìn)行本研究時(shí)間點(diǎn)的矯正。本研究利用Pacheco等人依據(jù)化石記錄對鳥類多個(gè)目進(jìn)行的分歧時(shí)間推斷結(jié)果[9]，鵜形目和鸛形目(Ciconiiformes)中的黃嘴白鷺(Egrettaeulophotes)的分化時(shí)間發(fā)生在68.92百萬年，鸛形目中的東方白鸛(Ciconiaboyciana)和白鸛(Ciconiaciconia)與企鵝目(Sphenisciformes)中的鳳頭黃眉企鵝(Eudypteschrysocome)和小藍(lán)企鵝(Eudyptulaminor)的分歧時(shí)間發(fā)生在67.12百萬年，而鵜形目和企鵝目的分歧時(shí)間發(fā)生在72.25百萬年，特此，本研究選用這3個(gè)時(shí)間結(jié)點(diǎn)作為校正點(diǎn)，將GenBank下載的朱鹮COX1基因序列(序列信息見表1)和夜鷺COX1基因序列整理成一個(gè)FASTA文件，使用MEGA7轉(zhuǎn)換成可用于BEAST分析的格式。分析時(shí)采用放松的分子鐘模型(the relaxed molecular clock models)，依據(jù)Jmodeltest結(jié)果，采用GTR+gamma+I模型，樹的先驗(yàn)值計(jì)算選擇Yule progress模型，共計(jì)運(yùn)行1000萬代，每1000代進(jìn)行一次抽樣，最后將100萬代(10%)作為burn-in進(jìn)行舍棄。使用Tracer v1.6(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/tracer/)評估結(jié)果的穩(wěn)定性，F(xiàn)igtree v1.4進(jìn)行樹文件的查看。Adobe Illustrator CS4進(jìn)行樹文件的編輯和美化。

圖2 基于COX1基因構(gòu)建的夜鷺的系統(tǒng)發(fā)生樹，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來自最大似然樹(分支上的支持度依次為BI/NJ)

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)育發(fā)生關(guān)系分析

采用最大似然法和貝葉斯法，基于線粒體COX1基因構(gòu)建的來自不同國家的20只夜鷺的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2。兩種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致，以最大似然樹的結(jié)構(gòu)進(jìn)行展示。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，可見以作為外群的白鷺屬單獨(dú)為一支系，很好地和內(nèi)群夜鷺分開，并未存在長枝吸引問題，說明白鷺屬是夜鷺屬可靠的外群。夜鷺整體分為兩個(gè)支系，一支由來自中國、印度、日本、伊拉克和韓國的夜鷺構(gòu)成，本研究稱之為亞洲支系；另一支系由來自美國、厄瓜多爾共和國和阿根延的夜鷺組成，本研究定義為美洲支系。亞洲支系和美洲支系互為姐妹群，分支支持率分別為1和100%，說明亞洲和美洲的分離即地理隔離可能是導(dǎo)致夜鷺分化的主要因素，長期的地理隔離導(dǎo)致生殖隔離。亞洲支系內(nèi)部和美洲支系內(nèi)部也存在分化，支持率均在0.85以上，說明夜鷺在各自生活的大洲上均持續(xù)進(jìn)行著獨(dú)立進(jìn)化。

2.2 分歧年代分析

使用BEAST軟件，基于夜鷺和朱鹮的線粒體COX1基因，使用鵜形目和鸛形目的分歧時(shí)間點(diǎn)68.92百萬年、鸛形目和企鵝目的分歧時(shí)間結(jié)點(diǎn)67.12百萬年及企鵝目與鵜形目的分歧時(shí)間結(jié)點(diǎn)72.25百萬年作為校正點(diǎn)，Tracer中，觀察到ESS值大于200，說明BEAST軟件中各參數(shù)設(shè)置合理，最終得到的夜鷺的分歧時(shí)間樹(見圖3)。由圖3可見，夜鷺依然分為亞洲支系和美洲支系，再次說明夜鷺的分化與亞洲板塊與美洲板塊的分離有關(guān)；支系內(nèi)具體的地點(diǎn)可見圖2或者表1，兩支系的分歧時(shí)間發(fā)生在距今約56.74百萬年，說明兩世系的分化發(fā)生在新生代早第三紀(jì)古新世。美洲支系在距今約35.34百萬年再次發(fā)生分化，這一節(jié)點(diǎn)處于新生代早第三紀(jì)始新世。亞洲支系在距今約36.68百萬年發(fā)生了分化，分化時(shí)間依然處于早第三紀(jì)始新世。但從分化時(shí)間上可知，亞洲支系的分化略早于美洲支系。

圖3 基于線粒體COX1基因推測的夜鷺的分化時(shí)間圖(分支上的數(shù)字表示分歧時(shí)間, 單位：百萬年)

Figure 3 Chronogram showing estimated dates of divergence among Black-crowned Night Heron lineages (Numbers on each branch refer to divergence time, unit: million years)

3 討論

本研究通過系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和分歧年代評估的方法探索了夜鷺的進(jìn)化歷史。BEAST被認(rèn)為是評估物種分歧年代的一個(gè)可靠軟件，運(yùn)算結(jié)果與MDT軟件運(yùn)行結(jié)果相似[9]，因此本研究僅選用BEAST進(jìn)行分歧時(shí)間的估算，結(jié)果表明：夜鷺第一次分化發(fā)生在新生代早第三紀(jì)始新世贊尼特期(距今56.0～59.2百萬年)，晚于現(xiàn)代鳥類的輻射時(shí)間，65百萬前的白堊紀(jì)-第三紀(jì)又稱K-T邊界[25]，再次證明分歧時(shí)間推斷的合理性和準(zhǔn)確性。這一分化時(shí)間與鴿形目(Columbiformes)的分化時(shí)間相似[26], 說明夜鷺和鴿形目鳥類的祖先并沒有在大滅絕事件(65百萬年)中滅絕，而是繼續(xù)發(fā)生演化。夜鷺的分化時(shí)間早于許多鳥類，如暗腹雪雞(Tetraogallushimalayensis)的分歧時(shí)間發(fā)生在中更新世[27]，環(huán)頸雉(Phasianuscolchicus)的分歧時(shí)間發(fā)生在晚更新世[28]，大山雀(Parusmajor)的分歧時(shí)間發(fā)生在早-中更新世[29]，說明夜鷺也是一個(gè)比較古老的類群。

新生代以來，地殼的演化已與現(xiàn)代十分相似，歐洲、亞洲、非洲、美洲等持續(xù)向當(dāng)今位置漂移。在始新世，植物和海洋動(dòng)物區(qū)系與現(xiàn)今十分接近，許多現(xiàn)代鳥類也是在這一時(shí)期首次出現(xiàn)，本研究只能證明夜鷺在這一時(shí)期出現(xiàn)了分化，無法證明其是否首次出現(xiàn)。夜鷺的亞洲支系和美洲支系的再一次分化均發(fā)生在始新世的普里阿邦階(33.9～37.8百萬年)，美洲支系的分化略晚于亞洲支系。生物大滅絕事件(extinction event)發(fā)生在始新世晚期，所以亞洲和美洲支系的分化，可能與生物大滅絕事件有關(guān)。全球變冷的趨勢也發(fā)生在始新世晚期，因此，亞洲和美洲支系的分化也可能與氣候有關(guān)。在始新世，各大洲都在向當(dāng)今所在位置漂移，所以研究結(jié)果支持大陸漂移學(xué)說，支持大陸分離是禽類物種形成事件的驅(qū)動(dòng)力這一理論[30]。

由于缺乏分布于歐洲和非洲的夜鷺的COX1基因，本研究無法全面探討夜鷺的進(jìn)化歷史，無法理清夜鷺在氣候變暖、氣候變冷等極端環(huán)境下是如何生存的，無法給出明確解釋亞洲大陸生存的夜鷺與美洲生存的夜鷺是否通過白令海峽進(jìn)行交流，這些問題在后續(xù)可獲得這部分樣本時(shí)，將進(jìn)一步討論。

4 結(jié)論

本研究通過對涵蓋亞洲和美洲不同國家的20只夜鷺樣本，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和分歧年代評估，并與其他已有相關(guān)研究成果進(jìn)行對比，得出以下結(jié)論：1) 夜鷺整體分為亞洲支系和美洲支系兩個(gè)支系，分歧時(shí)間為56.74百萬年左右，分歧原因可能是大陸分離導(dǎo)致的；2) 亞洲支系和美洲支系的分化可能與生物大滅絕事件或者氣候變冷有關(guān)。