徐 陽(yáng)， 龔榜初， 吳開云， 江錫兵， 孫維敏， 胡衛(wèi)濱， 陳喜良

(1. 中國(guó)林科院亞熱帶林業(yè)研究所, 杭州 311400； 2．浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 311400； 3. 浙江省金華武義縣林業(yè)科技推廣站, 金華 321200； 4. 浙江萬(wàn)壽康生物科技有限公司, 金華 321200)

板栗(Castaneamollissima)是我國(guó)重要的特色堅(jiān)果，栽培歷史久，種植面積廣，但目前栗園普遍低產(chǎn)低效[1-2]。掌葉覆盆子(Rubuschingii)為薔薇科懸鉤子屬落葉灌木，果實(shí)具有固精、益腎等保健功能[3-4]，市場(chǎng)需求增大，極具推廣價(jià)值[4-5]。充分利用板栗林下豐富的空間、土壤與水源條件，改變單一種植模式，進(jìn)行掌葉覆盆子套種，短期內(nèi)可產(chǎn)生較高經(jīng)濟(jì)效益[5]。但板栗-掌葉覆盆子復(fù)合模式中土壤養(yǎng)分及土壤生態(tài)等指標(biāo)，尚未開展系統(tǒng)評(píng)價(jià)，科學(xué)而可持續(xù)的經(jīng)營(yíng)技術(shù)體系尚未建立。

土壤細(xì)菌參與土壤有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化[6]，其群落結(jié)構(gòu)關(guān)系到土壤的可持續(xù)利用和抗壓力，是土壤養(yǎng)分、質(zhì)量和生態(tài)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[7]。近年來(lái)，成熟的宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)為土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演變及多樣性研究提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)保障。目前，雖板栗共生菌根真菌研究較為深入[8-9]，但板栗林土壤細(xì)菌方面的研究，尚處于起步階段。徐秋芳等研究發(fā)現(xiàn)集約栽培的板栗林，頭10年里，土壤微生物群落功能多樣性下降趨勢(shì)明顯，10年后則變化不大[10]。秸稈腐解物覆蓋經(jīng)營(yíng)可顯著影響板栗林土壤氨化細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量[11]。而關(guān)于板栗林土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)的研究則鮮有報(bào)道。為此，本文采用高通量測(cè)序技術(shù)，從微觀角度闡述不同掌葉覆盆子套種密度的板栗林土壤養(yǎng)分及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，為生產(chǎn)中板栗-掌葉覆盆子復(fù)合經(jīng)營(yíng)技術(shù)提供依據(jù)，為科學(xué)評(píng)價(jià)該種植模式的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)處理與材料

試驗(yàn)地位于浙江省金華市武義縣王宅鎮(zhèn)。10年生板栗林，林相整齊，主栽品種為毛板紅(CastaneamollissimaBL Maobanhong)。于海拔700～800 m處，選擇土壤類型、質(zhì)地相似的3個(gè)地塊，每地塊約4畝。2014年冬，林下整地，2015年春，掌葉覆盆子分株栽植，分別設(shè)置板栗純林模式(0株掌葉覆盆子/畝，CM)、低密度掌葉覆盆子的板栗-復(fù)合模式(100株掌葉覆盆子/畝，CMRC1)及高密度板栗-復(fù)合模式(400株掌葉覆盆子/畝，CMRC2)。

1.2 取樣方法

2017年夏，掌葉覆盆子進(jìn)入穩(wěn)產(chǎn)成熟期。 2017年10月底，分別在CM、CMRC1與CMRC2模式地塊內(nèi)，每模式選定3個(gè)采樣區(qū)(每樣區(qū)20 m×20 m)，采樣區(qū)內(nèi)以Z型選5個(gè)樣點(diǎn)，采集0～20 cm深的土樣，混合均勻，共計(jì)9份土樣。土樣去除石礫和植物殘?bào)w，過(guò)2 mm鋼篩后分2份保存: 一份冷凍，用于提取土壤細(xì)菌DNA; 另一份室內(nèi)自然風(fēng)干，用于土壤基本理化分析。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤因子檢測(cè)

委托國(guó)家林業(yè)局經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心(杭州)按常規(guī)法分別測(cè)定土壤中水溶性鹽分含量、有機(jī)質(zhì)含量、全氮含量、水解性氮含量、全磷含量、有效磷含量、全鉀含量、速效鉀含量、交換性鈣含量、交換性鎂含量、pH值。

1.3.2 土壤細(xì)菌16S rDNA基因測(cè)序

采用 Fast DNA SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals, USA)試劑盒，分別提取9個(gè)土樣細(xì)菌總DNA，用瓊脂糖凝膠電泳及Agilent 2100 Bioanalyzer、超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量與濃度，合格的DNA稀釋為10 ng/μL，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取10 ng土壤DNA為模板，設(shè)計(jì)16S rDNA V4-V5區(qū)特定引物擴(kuò)增特異區(qū)域，委托南京集思慧遠(yuǎn)生物工程有限公司采用Illumina Hiseq 2500平臺(tái)，采用PE250測(cè)序策略進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

原始序列質(zhì)控后，用Usearch軟件[12]進(jìn)行去嵌合體、聚類和隨機(jī)抽平處理，以97%相似度為標(biāo)準(zhǔn)，提取對(duì)應(yīng)OTUs (Operational Taxonomic Units)。利用QIIME軟件[13]對(duì)抽平后的OTUs進(jìn)行分析，對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行物種分類。歸類后，根據(jù)每個(gè)OTU中序列的條數(shù)，從而得到OTU豐度表，最后根據(jù)該OTU豐度表進(jìn)行后續(xù)分析。

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行DUNCAN新復(fù)極差法比較，各指標(biāo)用不同大寫字母表示差異顯著 (P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤環(huán)境因子分析

表1顯示，掌葉覆盆子套種后，板栗林土壤有機(jī)質(zhì)及全氮、水解性氮、有效磷、全磷含量增加，但隨套種密度提升，又顯著回落。其中土壤有機(jī)質(zhì)及水解性氮最明顯，有機(jī)質(zhì)從CM中23.57 g/kg上升到CMRC1中的37.13 g/kg，套種密度升高后，又回落到26.67 g/kg。土壤水解性氮含量從CM中122.33 mg/kg上升到CMRC1中的301.67 mg/kg，掌葉覆盆子密度升高后，也回落到145.67 mg/kg，但仍顯著高于板栗純林。土壤全鉀與速效鉀含量隨掌葉覆盆子密度提升反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中速效鉀含量從CM中58.73 mg/kg顯著下降到CMRC1中的45.10 mg/kg，密度升高后，又顯著下降到35.23 mg/kg。土壤交換性鈣與交換性鎂含量則在掌葉覆盆子密度在400株/畝時(shí)，從純林和低密度的46.93、28.63 mg/kg與10.7、13.73 mg/kg分別顯著升高到210.33與79.43 mg/kg。

2.2 土壤細(xì)菌序列分析

對(duì)3個(gè)處理(9樣本)的土壤細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA高通量測(cè)序，分別得到25 976～39 100條序列。將序列抽平至18 296條后，在97%的相似水平下，共獲得6414個(gè) OTUs。抽平后，所有土壤樣本OUTs數(shù)目均介于2071～2724之間。各樣品測(cè)序覆蓋率均在0.93 以上，表明樣品序列測(cè)序量足以覆蓋樣品菌群組成，序列未測(cè)到概率低。

表1 不同掌葉覆盆子套種密度的板栗林土壤理化性質(zhì)

2.3 掌葉覆盆子套種對(duì)板栗林土壤細(xì)菌豐度及多樣性的影響

OTUs維恩圖(圖1)表明，各模式樣品共有OTUs數(shù)量為980個(gè)。CMRC2樣本特異性O(shè)TUs數(shù)量最多，為1010個(gè)，CM特異性O(shè)TUs數(shù)量最少，為674個(gè)，表明不同種植模式土壤細(xì)菌多樣性存在一定差異。

表2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)

圖1 不同掌葉覆盆子套種密度的板栗林土壤細(xì)菌群落 OTUs 維恩圖
Figure 1 Venn diagram of bacterial OTUs of Chestnut soil with different inter-planting densities of Raspberry

樣本多樣性指數(shù)(表2)顯示，板栗-掌葉覆盆子模式(CMRC1、CMRC2)的土壤微生物 Chao1指數(shù)(3859.58、3985.08)顯著高于板栗純林(CM，3133.97)，但兩種套種模式間Chao1指數(shù)差異不顯著，表明套種掌葉覆盆子后，能顯著提高板栗林土壤細(xì)菌豐富度，但掌葉覆盆子密度對(duì)土壤細(xì)菌影響不顯著。Shannon指數(shù)隨掌葉覆盆子套種密度提高呈增勢(shì)，但不顯著，表明板栗林土壤微生物多樣性較穩(wěn)定，一定密度的掌葉覆盆子套種對(duì)其影響不顯著。低密度套種掌葉覆盆子的板栗林Simpson 指數(shù)與板栗純林差異不顯著，而套種掌葉覆盆子在400株/畝左右時(shí)，Simpson指數(shù)為0.992，顯著高于其他模式，顯示此時(shí)的土壤微生物優(yōu)勢(shì)種突出，但土壤多樣性顯著下降。

2.4 掌葉覆盆子套種對(duì)板栗林土壤主要細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

門分類水平上，板栗林土壤細(xì)菌分布在20個(gè)已知細(xì)菌門。各處理優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落組成基本一致。板栗純林土樣中屬于變形菌門(Proteobacteria)與酸桿菌門(Acidobacteria)的序列分占全部序列的31.20%和29.70%，放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)與疣微菌門(Verrucomicrobia)序列占6%～8%，這6門的序列總比例達(dá)89%左右，為板栗林土壤中優(yōu)勢(shì)菌落。此外各模式土壤中芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)與厚壁菌門(Firmicutes)序列比例也在1%以上。

精確到目水平，板栗純林土壤樣本中屬于變形菌門的弧菌目(Vibrionales，7.80%)、根瘤菌目(Rhizobiales，5.53%)、紅螺菌目(Rhodospirillales，3.38%)、黏球菌目(Myxococcales，2.23%)、黃色單胞菌目(Xanthomonadales，2.61%)、亞硝化單胞菌目(Nitrosomonadales，2.08%)、伯克氏菌目(Burkholderiales，2.43%)及浮霉菌門的浮霉菌目(Planctomycetales，7.20%)，酸桿菌門的酸桿菌目(Acidobacteriales，6.38%)，疣微菌門纖線桿菌目(Ktedonobacterales)芽單胞菌門的芽單胞菌目(Gemmatimonadales，1.97%)及Solibacterales(5.94%)、Subgroup 10(1.87%)的菌種總和占總比例的50%以上，為目層次上的優(yōu)勢(shì)菌落。

分別在門與目水平對(duì)各模式土壤細(xì)菌群落構(gòu)建分層聚類圖(圖2)，3個(gè)模式土樣均明顯地分成2大類。門水平上，板栗純林土壤單獨(dú)為一支；掌葉覆盆子套種的2個(gè)栗林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較接近，聚為一支。而目水平上，低密度和無(wú)掌葉覆盆子套種的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較接近，聚為一支；高密度套種的土壤樣本單獨(dú)為一支。這或許暗示了掌葉覆盆子套種對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上影響較大，而套種掌葉覆盆子需在達(dá)到一定密度后，才在目水平上對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響。

由圖2和圖4進(jìn)一步分析掌葉覆盆子套種對(duì)板栗林土壤細(xì)菌豐度的影響。門水平上，土壤細(xì)菌豐度顯著變化同樣主要出現(xiàn)套種掌葉覆盆子后，其中酸桿菌門、放線菌門、迷蹤菌門(Elusimicrobia)、疣微菌門與芽單胞菌門細(xì)菌豐度顯著上升，但高密度掌葉覆盆子套種下酸桿菌門略有回落；變形菌門與浮霉菌門細(xì)菌豐度明顯下降，但隨密度提高，略有上升。而綠彎菌門細(xì)菌豐度呈先升高后下降的趨勢(shì)。目水平上，土壤細(xì)菌豐度隨掌葉覆盆子套種密度呈顯著變化(圖3和圖5)?；【?、浮霉菌目、根瘤菌目、伯克氏菌目在掌葉覆盆子套種后豐度顯著下降，其中弧菌目變化最明顯，從板栗純林CM中7.80%顯著下降到CMRC1中0.46%，掌葉覆盆子密度增加后，顯著下降到0.005%。紅螺菌目、黏球菌目與芽單胞菌目在掌葉覆盆子套種后豐度顯著上升。而Solibacterales、黃色單胞菌目、亞硝化單胞菌目、纖線桿菌目、Subgroup 10則在高密度掌葉覆盆子套種時(shí)才發(fā)生顯著變化，其中Solibacterales、Subgroup 10、黃色單胞菌目、亞硝化單胞菌目顯著增高，而纖線桿菌目顯著降低。酸桿菌目細(xì)菌豐度(6.38%)隨掌葉覆盆子套種密度呈先升高(7.87%)后下降(6.27%)的趨勢(shì)。

圖中左側(cè)聚類樹為物種聚類樹; 上方為樣品聚類樹; 熱圖顏色表示每行細(xì)菌門標(biāo)準(zhǔn)化后的相對(duì)豐度

圖 2 不同掌葉覆盆子套種密度的板栗林土壤細(xì)菌門分層聚類
Figure 2 Hierarchical clustering analysis for bacterial phylum community in Chestnut soil with different inter-planting densities of Raspberry

圖中左側(cè)聚類樹為物種聚類樹; 上方為樣品聚類樹; 熱圖顏色表示每行細(xì)菌目標(biāo)準(zhǔn)化后的相對(duì)豐度

圖 3 不同掌葉覆盆子套種密度的板栗林土壤細(xì)菌目分層聚類
Figure 3 Hierarchical clustering analysis for bacterial order community in Chestnut soil with different inter-planting densities of Raspberry

2.5 土壤細(xì)菌與土壤因子RDA分析

分別在門和目水平上分析土壤細(xì)菌種群與環(huán)境因子關(guān)系。排序圖(圖6)前兩軸可解釋栗林土壤細(xì)菌群落變異程度的95.4%及94.6%，表明土壤環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較大，排序軸前兩軸能真實(shí)地反映環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落的影響程度，其中，土壤水溶性鹽分含量(r=-0.802)、有效磷含量(r= 0.864)、全鉀含量(r=-0.637)、速效鉀含量(r=-0.946)、交換性鈣(r= 0.909)以及交換性鎂(r= 0.955)與軸1相關(guān)性較大。

圖 4 不同掌葉覆盆子套種密度的板栗林土壤各門細(xì)菌相對(duì)豐度圖Figure 4 The relative abundance of bacterial phylum in Chestnut soil with different interplanting densities of Raspberry

圖 5 不同掌葉覆盆子套種密度的板栗林土壤各目細(xì)菌相對(duì)豐度圖Figure 5 The relative abundance of bacterial order in Chestnut soil with different inter-planting densities of Raspberry

門水平上，RDA三序圖(圖6-A)顯示綠彎菌門、GAL15、Ignavibacteriae與土壤水溶性鹽分含量相關(guān)性最大；變形菌門、厚壁菌門、藍(lán)藻門、浮霉菌門與土壤速效鉀含量相關(guān)性較大；酸桿菌門與土壤水解性氮相關(guān)性最大；Latescibacteria、硝化螺旋菌門、綠彎菌門與土壤有機(jī)質(zhì)含量相關(guān)性最大；疣微菌門、迷蹤菌門則與掌葉覆盆子密度密切相關(guān)，奇古菌門、芽單胞菌門、裝甲菌門、放線菌門與土壤交換性鈣含量密切相關(guān)。目水平上(圖6-B)，纖線桿菌目與土壤水溶性鹽分含量相關(guān)性最大；酸桿菌目、Blastocatellales與土壤全氮含量、土壤水解性氮含量密切相關(guān)；弗蘭克氏菌亞目、硫還原菌目與土壤有機(jī)質(zhì)含量密切相關(guān)；芽單胞菌目、紅螺菌目、黏球菌目與土壤有效磷含量相關(guān)性最大；黃色單胞菌目、亞硝化單胞菌目與土壤交換性鈣含量密切相關(guān)；Chthoniobacterales、Solirubrobacterales與土壤pH值密切相關(guān)。

RDA三序圖也表明：門水平上，板栗純林樣本均聚集在右側(cè)，而高密度和低密度掌葉覆盆子套種樣本則共同聚集在左側(cè)。而目水平上，各模式內(nèi)樣本明晰地分聚在一起。浮霉菌目、根瘤菌目、伯克氏菌目、弧菌目、伯克氏菌目與板栗純林的3個(gè)樣本(CM1、CM2、CM3)分布相關(guān)密切。酸桿菌目、Blastocatellales與CMRC1樣本(CMRC1.1、CMRC1.2、CMRC1.3)分布密切相關(guān)。Solibacterales、Subgroup 10、黃色單胞菌目、亞硝化單胞菌目細(xì)菌與CMRC2樣本(CMRC2.1、CMRC2.2、CMRC2.3)分布密切相關(guān)。

D：掌葉覆盆子密度、WS：土壤水溶性鹽分含量、OM：土壤有機(jī)質(zhì)含量、TN：土壤全氮含量、HN：土壤水解性氮含量、AP：土壤有效磷含量、TP：土壤全磷含量、TK：土壤全鉀含量、Ak：土壤速效鉀含量、ECa：土壤交換性鈣含量、EMg：土壤交換性鎂含量、pH：土壤pH值。1：CM1、2：CM2、3：CM3:、4：CMRC1.1、5：CMRC1.2、6：CMRC1.3、 7：CMRC2.1、8：CMRC2.2、9：CMRC2.3。優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(A圖)。Acid：Acidobacteria酸桿菌門、Prot：Proteobacteria變形菌門、Acti：Actinobacteria放線菌門、Chlo：Chloroflexi綠彎菌門、Plan：Planctomycetes浮霉菌門、Verr：Verrucomicrobia疣微菌門、Gemm：Gemmatimonadetes芽單胞菌門、Bact：Bacteroidetes擬桿菌門、Nitr：Nitrospirae硝化螺旋菌門、Firm：Firmicutes厚壁菌門、Arma：Armatimonadetes裝甲菌門、Elus：Elusimicrobia迷蹤菌門、Cyan：Cyanobacteria藍(lán)藻門、 GAL1：GAL15、Thau：Thaumarchaeota奇古菌門、Late：Latescibacteria、Igna：Ignavibacteriae、Chla：Chlamydiae衣原體門、Tect：Tectomicrobia、Chlo：Chlorobi綠菌門。優(yōu)勢(shì)細(xì)菌目(B圖)。Plan：Planctomycetales浮霉菌目、Rhiz：Rhizobiales根瘤菌目、Acid：Acidobacteriales酸桿菌目、Soli：Solibacterales、Rhod：Rhodospirillales紅螺菌目、Myxo：Myxococcales黏球菌目、Xant：Xanthomonadales黃色單胞菌目、Nitr：Nitrosomonadales亞硝化單胞菌目、Kted：Ktedonobacterales纖線桿菌目、Gemm：Gemmatimonadales芽單胞菌目、Burk：Burkholderiales伯克氏菌目、Subg：Subgroup 10、Fran：Frankiales弗蘭克氏菌亞目、Nitr：Nitrospirales硝化螺旋菌目、Gaie：Gaiellales、Blas：Blastocatellales、Vibr：Vibrionales弧菌目、Chth：Chthoniobacterales、Desu：Desulfurellales硫還原菌目、Soli：Solirubrobacterales

圖6 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(A)和優(yōu)勢(shì)細(xì)菌目(B)與土壤環(huán)境因子冗余分析

Figure 6 Redundancy analysis on soil dominant bacteria phylum (A) and soil dominant bacteria order (B) constrained by soil variables

3 討論

3.1 掌葉覆盆子套種對(duì)栗林土壤環(huán)境因子的影響

栗園套種藥材后，耕作更為細(xì)密，對(duì)林地土壤理化性質(zhì)有一定的改良作用，但不同養(yǎng)分改良效益存在差異。林下套種掌葉覆盆子后，增加了林分地被物及凋落物，固定了土壤養(yǎng)分[14]，從而使土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、水解性氮、有效磷、全磷含量顯著增加。較高的氮元素含量，也相應(yīng)降低了土壤pH值。但套種密度提升后，板栗-掌葉覆盆子系統(tǒng)中元素需求增加，土壤有機(jī)質(zhì)、水解性氮含量有所回落。鉀元素為果實(shí)發(fā)育中關(guān)鍵元素[15-16]，在掌葉覆盆子開花結(jié)實(shí)過(guò)程中大量消耗，于是系統(tǒng)中土壤鉀元素隨套種密度提升而顯著下降的趨勢(shì)更為明顯。這些或許暗示林地套種結(jié)果作物在改良土壤的同時(shí)，也增加了系統(tǒng)元素需求負(fù)荷，生產(chǎn)中需合理控制套種密度并適時(shí)增施肥料。

3.2 掌葉覆盆子套種對(duì)栗林土壤細(xì)菌群落的影響

門分類水平上，各模式細(xì)菌組成較一致，但各門相對(duì)豐度不同。板栗純林土壤優(yōu)勢(shì)菌種為變形菌門(31.2%)與酸桿菌門(29.7%)，其他，放線菌門、綠彎菌門、浮霉菌門與疣微菌門也均為森林土壤的常見(jiàn)門類[17]。與其他研究一致[17-18]，板栗純林土壤中變形菌門數(shù)量最高，主要為弧菌目(7.8%)、根瘤菌目(5.53%)、紅螺菌目(3.38%)、黏球菌目(2.23%)、黃色單胞菌目(2.61%)。其中紅螺菌目多為光合細(xì)菌和固氮細(xì)菌，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)氮的穩(wěn)定性和土壤能量的平衡起重要作用[19]。而弧菌目、根瘤菌目、黃色單胞菌目多是植物的病原體，能夠?qū)е罗r(nóng)作物病害[20]，這些目細(xì)菌在板栗純林土樣中存在較高含量，或許與板栗純林長(zhǎng)年種植后，土壤中病原菌數(shù)量大量增加，益生菌數(shù)量下降等土壤遭受脅迫有關(guān)[21-22]。板栗林土壤中酸桿菌門相對(duì)含量與亞馬遜原始森林等森林土壤(20%～30%)相當(dāng)[23-24]，而高于農(nóng)田土壤樣本中13%～24%的含量[25-26]，也與板栗林中變形菌門數(shù)量相當(dāng)。通常，酸桿菌門是土壤中僅次于變形菌門的第二大微生物類群，板栗林土壤中酸桿菌含量的提升或許和較高海拔的分布有一定關(guān)系[24]。

土壤細(xì)菌Chao1指數(shù)與分層聚類均表明，掌葉覆盆子套種可對(duì)栗林土壤細(xì)菌門群落產(chǎn)生影響。套種一定密度掌葉覆盆子后，才在目水平上對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響。這或許是套種后，土壤養(yǎng)分含量顯著增大，促進(jìn)了土壤細(xì)菌的繁殖[19, 27]。正如數(shù)據(jù)顯示，土壤細(xì)酸桿菌門與放線菌門、迷蹤菌門、疣微菌門、芽單胞菌門細(xì)菌以及變形菌門的紅螺菌目與黏球菌目豐度顯著上升。套種掌葉覆盆子后，同時(shí)也優(yōu)化了土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)[28]，弧菌目、黃色單胞菌目、根瘤菌目等有害菌數(shù)量減少，其中，弧菌目最為明顯，從CM樣本中的7.8%驟減到CMRC1中的0.46%及CMRC2中的0.005%。而高密度套種下，土壤養(yǎng)分結(jié)構(gòu)等較板栗純林有較大改變，Simpson指數(shù)顯著提高，土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)度增加，多樣性下降，使得土壤細(xì)菌豐度及組成結(jié)構(gòu)在目水平上重新調(diào)整[19]。同樣數(shù)據(jù)也顯示，Solibacterales、黃色單胞菌目、亞硝化單胞菌目、纖線桿菌目、Subgroup 10則在低密度套種中變化不明顯，高密度時(shí)才發(fā)生顯著變化，細(xì)菌結(jié)構(gòu)重新調(diào)整，逐步形成新的相對(duì)優(yōu)勢(shì)群落，達(dá)到一個(gè)新的相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。

3.3 土壤細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子的關(guān)系

RDA結(jié)果顯示，土壤有機(jī)質(zhì)、氮等養(yǎng)分含量變化對(duì)土壤細(xì)菌群落產(chǎn)生影響。Magill等對(duì)森林土壤的研究表明，酸桿菌門在土壤氮循環(huán)中起重要作用，土壤氮含量的增加會(huì)使酸桿菌門多樣性增加[29]，同樣板栗-掌葉覆盆子系統(tǒng)中酸桿菌門與土壤水解性氮相關(guān)性最大，酸桿菌目與土壤全氮含量、土壤水解性氮含量密切相關(guān)。同時(shí)模式間酸桿菌門相對(duì)豐度的變化和土壤氮含量的變化基本一致，這也與酸桿菌門可作為較貧瘠土壤環(huán)境指標(biāo)的結(jié)論一致[30]。綠彎菌門是一類通過(guò)光合作用產(chǎn)生能量的兼性厭氧類細(xì)菌，其數(shù)量的變化可能同土壤中有機(jī)質(zhì)增加有關(guān)[23]，同樣RDA結(jié)果也顯示綠彎菌門與土壤有機(jī)質(zhì)含量相關(guān)性最大。