崔鶯文， 李文明， 錢燕萍， 田如男， 李云龍

(1. 南京林業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院， 南京 210037；2. 中國(guó)科學(xué)院植物研究所 南京中山植物園， 南京 210014)

歐洲冬青為冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬(IlexL.)常綠灌木或小喬木，原產(chǎn)于歐洲[1]，喜溫暖、濕潤(rùn)氣候條件；樹形優(yōu)美，既可觀葉又可觀果，具有良好的應(yīng)用前景。我國(guó)先后從不同國(guó)家和地區(qū)引進(jìn)了50余種(含園藝品種)，并建立了種質(zhì)資源圃。曾雯等對(duì)引進(jìn)的9個(gè)雜種冬青(Ilexsp.)品種進(jìn)行抗寒性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)均能在北方推廣，這為向更高緯度地區(qū)引種及推廣應(yīng)用提供了理論依據(jù)[2]。本試驗(yàn)以歐洲冬青原種、2個(gè)歐洲冬青園藝雜交種和2個(gè)歐洲冬青品種為材料，進(jìn)行人工低溫處理，測(cè)定5種供試材料在不同低溫下的生理生化指標(biāo)，運(yùn)用主成分分析法和隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為其在南京地區(qū)的引種栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所提供的兩年生歐洲冬青原種、2個(gè)歐洲冬青園藝雜交種(‘長(zhǎng)葉阿爾塔’、‘金心阿爾塔’)和2個(gè)歐洲冬青品種(‘布利奧特夫人’、‘小寶石’)扦插苗為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別從每種供試材料的枝條頂端取第4～6片完全展開葉，每種供試材料取50片，采摘后立即用濕紗布包裹，裝入自封袋，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。將5種供試材料分別分成8組，用紗布包好，置于人工氣候箱，在8℃停留一周，然后降溫至4℃，停留12 h，取出第1組；繼續(xù)降溫至0℃，停留12 h，取出第2組；以此類推，直至降溫至-24℃，取出第8組。以4℃為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。

將低溫脅迫處理后取出的樣品置于4℃冰箱內(nèi)解凍24 h，然后進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

參照王學(xué)奎[3]的方法，測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、SOD活性、可溶性糖含量和葉綠素總含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過電導(dǎo)法配以Logistic方程Y=K/(1+ae-bx)計(jì)算5種供試材料的低溫半致死溫度(LT50)[4]。

采用主成分分析法和模糊隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)5種供試材料的抗寒性[5]。首先，運(yùn)用主成分分析法計(jì)算各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，采用模糊隸屬函數(shù)法計(jì)算各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；然后，將對(duì)應(yīng)的權(quán)重系數(shù)與隸屬函數(shù)值相乘，對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行合成并計(jì)算抗寒性綜合指數(shù)，根據(jù)抗寒性綜合指數(shù)進(jìn)行抗寒性評(píng)定。

用Microsoft Excel 2007和SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下5種歐洲冬青的低溫半致死溫度

在低溫脅迫下，5種供試材料的相對(duì)電導(dǎo)率隨著處理溫度的降低呈“S”型曲線上升，但不同供試材料的上升幅度相差較大。通過Logistic方程擬合，求出5種供試材料的低溫半致死溫度(表1)。5種供試材料的LT50在-13℃～-24℃之間，‘長(zhǎng)葉阿爾塔’、‘金心阿爾塔’、‘歐洲冬青原種’、‘布利奧特夫人’、‘小寶石’的低溫半致死溫度分別為-24.2℃、-13.1℃、-21.0℃、-15.1℃、-15.3℃。當(dāng)溫度降低到-16℃時(shí)，‘布利奧特夫人’葉片的部分邊緣由黃色變?yōu)楹稚?，呈煮熟狀；‘金葉阿爾塔’葉片邊緣變?yōu)楹稚?，中間葉片出現(xiàn)銹色斑點(diǎn)；‘小寶石’葉片背面出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，‘長(zhǎng)葉阿爾塔’和‘歐洲冬青原種’變化不大。

表1 5種供試材料的低溫半致死溫度(LT50)及擬合度(R2)

2.2 低溫脅迫下5種歐洲冬青的MDA含量的變化

在低溫脅迫下，5種供試材料的MDA含量隨著處理溫度的降低呈先上升后下降的趨勢(shì)(表2)。在-12℃時(shí)，‘長(zhǎng)葉阿爾塔’、‘金心阿爾塔’、‘布利奧特夫人’和‘小寶石’的MDA含量達(dá)到最大值，分別比對(duì)照組高28.7%、28.5%、26.30%和37.78%。在-8℃時(shí)，歐洲冬青原種的MDA含量達(dá)到最大值，比對(duì)照組高51.97%。

表2 低溫脅迫對(duì)5種供試材料MDA含量的影響

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)；下同

2.3 低溫脅迫下5種歐洲冬青的SOD活性變化

在低溫脅迫下，5種供試材料的SOD活性隨著處理溫度的降低變化趨勢(shì)相同，均呈先下降后上升再下降趨勢(shì)，但增加幅度不同(表3)。在-12℃時(shí)，5種供試材料的SOD活性出現(xiàn)高峰，但比對(duì)照組低，‘布利奧特夫人’的SOD活性降幅最大，比對(duì)照組低23.96%。

表3 低溫脅迫對(duì)5種供試材料SOD活性的影響

2.4 低溫脅迫下5種歐洲冬青的可溶性糖含量變化

在低溫脅迫下，5種供試材料的可溶性糖含量隨著處理溫度的降低呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)(表4)。在-12℃時(shí)，‘金心阿爾塔’、‘歐洲冬青原種’、‘布利奧特夫人’的可溶性糖含量達(dá)到最大值，分別比對(duì)照組高41.06%、26.77%和25.47%。在-20℃時(shí)，‘長(zhǎng)葉阿爾塔’和‘小寶石’的可溶性糖含量達(dá)到最大值，分別比對(duì)照組高23.79%及23.21%。

表4 低溫脅迫對(duì)5種供試材料可溶性糖含量的影響

2.5 低溫脅迫下5種歐洲冬青的葉綠素總含量變化

在低溫脅迫下，5種供試材料的葉綠素總含量隨著處理溫度的降低而下降(表5)。在-24℃時(shí)，‘長(zhǎng)葉阿爾塔’、‘金心阿爾塔’、‘歐洲冬青原種’、‘布利奧特夫人’和‘小寶石’的葉綠素總含量達(dá)到最小值，分別比對(duì)照組低58.01%、45.59%、67.26%、70.88%及55.16%。

表5 低溫脅迫對(duì)5種供試材料葉綠素總含量的影響

2.6 5種歐洲冬青抗寒性綜合評(píng)價(jià)

2.6.1 抗寒性綜合評(píng)價(jià)體系的建立

植物的抗寒性是相關(guān)指標(biāo)綜合作用的結(jié)果，需建立抗寒性綜合評(píng)價(jià)體系，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行主成分分析。一般認(rèn)為，主成分分析中所提取主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到80%以上，就可以用這些主成分對(duì)事物的屬性進(jìn)行概括性分析。本研究的前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為97.78%(表6)，可以代表原始指標(biāo)的絕大部分信息。因此，以前3個(gè)主成分分析各指標(biāo)的負(fù)荷量，計(jì)算各指標(biāo)對(duì)5種供試材料抗寒性的作用大小。從表7可以看出，與5種供試材料抗寒性相關(guān)性最大的指標(biāo)是葉綠素總含量，其次是MDA含量。

表6 5種供試材料抗寒性指標(biāo)的特征根和貢獻(xiàn)率

2.6.2 5種歐洲冬青各指標(biāo)隸屬度值及抗寒性綜合指數(shù)

通過隸屬函數(shù)法求出各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，再乘以對(duì)應(yīng)的權(quán)重系數(shù)，累加求和得出綜合評(píng)定值。該值越大，抗寒性越強(qiáng)，并結(jié)合相關(guān)的抗性指標(biāo)進(jìn)行分析，則能較為準(zhǔn)確的判斷供試材料抗寒性強(qiáng)弱。從表8可以看出，5種供試材料的抗寒性強(qiáng)弱為：‘長(zhǎng)葉阿爾塔’>‘小寶石’>‘歐洲冬青原種’>‘布利奧特夫人’>‘金心阿爾塔’，這與低溫半致死溫度算出的結(jié)果有所差異。

表7 5種供試材料抗寒性指標(biāo)的負(fù)荷量和權(quán)重

表8 5種供試材料各指標(biāo)隸屬度值及抗寒性綜合指數(shù)

3 討論

在低溫脅迫下，植物的外部形態(tài)會(huì)發(fā)生明顯變化。因此，可以通過植物外部形態(tài)變化來確定其抗寒性，這種方法簡(jiǎn)單而又直接[5]。在低溫脅迫初期，‘金心阿爾塔’和‘布里奧特夫人’出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，其它3種供試材料無明顯變化；隨著脅迫程度的加劇，5種供試材料均出現(xiàn)不同程度的凍害癥狀，‘金心阿爾塔’呈煮熟狀，汁液外滲。通過外部形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，‘金心阿爾塔’和‘布里奧特夫人’的抗寒性相對(duì)較弱。

在正常情況下，植物細(xì)胞膜具有選擇滲透性；在低溫脅迫下，植物細(xì)胞膜會(huì)采取保護(hù)措施，適應(yīng)低溫環(huán)境。當(dāng)溫度降低到一定程度時(shí)，植物細(xì)胞膜受到不可逆的傷害，細(xì)胞膜透性增強(qiáng)，電導(dǎo)率增大，這種變化先于外部形態(tài)變化[6-11]。在低溫脅迫初期，5種供試材料的相對(duì)電導(dǎo)率隨著溫度的降低而緩慢上升，表明5種供試材料的細(xì)胞膜受到傷害；在-20℃時(shí)，5種供試材料的相對(duì)電導(dǎo)率急劇上升，表明此時(shí)供試材料受到的傷害程度最大，這與張富瑋等[12]研究結(jié)果相同。

在低溫脅迫下，植物體內(nèi)活性氧自由基積累，引發(fā)膜脂過氧化，產(chǎn)生大量的膜脂過氧化產(chǎn)物MDA[13]。MDA含量增加，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成受阻，細(xì)胞膜變性，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞受損、衰老甚至死亡。MDA的產(chǎn)生量是鑒定逆境脅迫對(duì)植物危害程度的重要指標(biāo)。在本試驗(yàn)中，5種供試材料的MDA含量隨著溫度的降低逐漸上升，表明在低溫下細(xì)胞膜產(chǎn)生大量的MDA，細(xì)胞膜受到傷害；MDA含量隨著溫度的降低而下降，這可能是代謝紊亂產(chǎn)生的結(jié)果[14-15]。

在低溫脅迫下，植物通過多種抗氧化酶來清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧，從而減少細(xì)胞的受害程度。抗氧化酶活性越高，植物的抗寒性越強(qiáng)[16-17]。本試驗(yàn)中，5種供試材料的SOD活性均隨著溫度的降低呈先下降后急劇上升再緩慢下降的趨勢(shì)，表明低溫脅迫下活性氧過量積累，破壞了活性氧和防御系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或酶的表達(dá)受到抑制，從而使酶的活性降低；當(dāng)溫度下降到一定程度，5種供試材料的SOD活性突然急劇上升，這可能是植物的保護(hù)應(yīng)激反應(yīng)，減輕低溫對(duì)生物膜的迫害。

可溶性糖是植物體內(nèi)的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以提高植物的滲透調(diào)節(jié)能力，增強(qiáng)植物的抗寒性，維持細(xì)胞膜的正常功能[18]。本試驗(yàn)中，5種供試材料的可溶性糖含量隨著處理溫度的降低呈先下降后上升的趨勢(shì)，抗寒性弱的上升幅度大，這可能是在低溫脅迫初期需要較多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來平衡低溫所帶來的危害[19]，但與董萬鵬等的“可溶性糖含量與植物的抗寒性呈正相關(guān)”結(jié)論不同[20]。

葉綠素的合成是一系列酶促反應(yīng)的結(jié)果，當(dāng)植物遭受低溫脅迫時(shí)，葉綠素的合成受阻，分解加速。在低溫脅迫下，葉綠素總含量下降；處理溫度越低，葉綠素總含量下降越明顯[21]。本試驗(yàn)中，5種供試材料的葉綠素總含量均隨著處理溫度的降低呈下降趨勢(shì)，‘長(zhǎng)葉阿爾塔’的葉綠素總含量相對(duì)較高，表明其抗寒性較其他4種強(qiáng)，該結(jié)論已在多種植物中被證實(shí)[22-23]。

植物是一個(gè)有機(jī)整體，受逆境脅迫而引起植物生理生化指標(biāo)變化的因素錯(cuò)綜復(fù)雜[24-25]。因此，單一指標(biāo)很難準(zhǔn)確評(píng)價(jià)植物的抗逆性[26-27]。本試驗(yàn)中，運(yùn)用隸屬函數(shù)法和主成分分析法綜合評(píng)價(jià)5種供試材料的抗寒性，‘長(zhǎng)葉阿爾塔’抗寒性最強(qiáng)，其次是‘小寶石’和‘歐洲冬青原種’，‘布利奧特夫人’和‘金心阿爾塔’抗寒性最弱。通過低溫半致死溫度求得的結(jié)果與綜合評(píng)定結(jié)果不一致，表明單一指標(biāo)很難準(zhǔn)確評(píng)價(jià)植物的抗寒性，有必要進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)其抗寒性。另外，綜合評(píng)價(jià)結(jié)果與田間觀察結(jié)果一致。

4 結(jié)論

通過主成分分析法和隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)得出5種供試材料的抗寒性大小依次為：‘長(zhǎng)葉阿爾塔’>‘小寶石’>‘歐洲冬青原種’>‘布利奧特夫人’>‘金心阿爾塔’。通過查閱資料發(fā)現(xiàn)，南京歷史上年最低溫有4次低于-13℃，但近20年沒有出現(xiàn)過年最低溫低于-10℃的嚴(yán)冬[28]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5種供試材料的低溫半致死溫度均低于-13℃。因此，這5種供試材料均具有在南京栽培推廣的潛力，且不易受到低溫傷害。將這5種供試材料引種馴化到南京，使其適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境，并將其擴(kuò)繁推廣，豐富南京的園林景觀。