張 蕊, 陳照娟, 姜秀麗, 王曉玲, 烏力吉, 孟和達(dá)來(lái), 陳 琛, 韓瑩瑩, 鮑偉東

(1. 北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 北京 100083; 2. 內(nèi)蒙古賽罕烏拉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局, 赤峰 025150； 3. 煙臺(tái)市福山區(qū)高疃鎮(zhèn)政府, 煙臺(tái) 265505)

激素水平的高低一定程度上決定了動(dòng)物生理狀態(tài)，對(duì)于激素水平的檢測(cè)往往可以有效地監(jiān)測(cè)動(dòng)物生理狀態(tài)變化，在動(dòng)物保護(hù)尤其是瀕危野生動(dòng)物的研究與保育中有著重要意義。但針對(duì)瀕危野生動(dòng)物激素水平的研究目前存在很多限制[1-2]，傳統(tǒng)方式例如直接采血等方法，雖能準(zhǔn)確獲得野生動(dòng)物的激素水平數(shù)據(jù)，但存在瀕危野生動(dòng)物數(shù)量稀少，捕獲難度大，捕獲過(guò)程中易對(duì)其造成傷害且易引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)等限制。在此背景下發(fā)展而來(lái)的基于非損傷性取樣的方法，雖然在激素水平數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確程度上不如傳統(tǒng)的直接采血方法，但能夠破除上述各種制約，獲得激素水平的相對(duì)變化趨勢(shì)，由此逐漸在野生動(dòng)物激素水平研究中廣泛應(yīng)用[3-5]。

國(guó)內(nèi)外基于非損傷性采樣法對(duì)瀕危野生動(dòng)物的類固醇性激素開(kāi)展了大量的研究[6-7]。在對(duì)神農(nóng)架自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)種群進(jìn)行的研究中，從糞便的保存方法及保存時(shí)效等角度探討了野生川金絲猴的繁殖生物學(xué)特征、應(yīng)激生理狀態(tài)等[8]。利用放射性免疫分析法(radio immunoassays, RIA)及化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法(solid-phase chemiluminescent enzyme immunoassay, SPCEI)對(duì)墨西哥坎佩切州的黑吼猴(Alouattapigra)種群的糞便性激素進(jìn)行了調(diào)查研究，并比較了兩種方法在測(cè)試皮質(zhì)醇激素(cortisol)、睪酮(testosterone)、雌二醇(estradiol)及孕酮(progesterone)水平上的差異，結(jié)果表明兩種方法在皮質(zhì)醇激素和睪酮檢測(cè)分析的有效性方面不存在差異，但放射性免疫分析法在檢測(cè)雌二醇和孕酮結(jié)果上相對(duì)更好[5]。

中華斑羚(Naemorhedusgriseus)為偶蹄目(Artiodactyla)、牛科(Bovidae)、斑羚屬(Naemorhedus)的國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，被列入國(guó)際自然與自然資源保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)《世界物種紅色名錄》近危級(jí)(NT)和瀕危野生動(dòng)植物物種國(guó)際貿(mào)易公約(CITES)附錄Ⅰ中[9-10]。斑羚活動(dòng)范圍比較固定，常在密林深處的懸崖峭壁間活動(dòng)，生性敏覺(jué)機(jī)警，一般單獨(dú)或成小種群生活[11]。成年斑羚懷孕期為6～8個(gè)月，每胎產(chǎn)1～2仔，哺乳期為2個(gè)月，1.5～2歲時(shí)達(dá)到性成熟，壽命為13～18年[12-13]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于斑羚的研究多集中在生境選擇、食性分析、家域分析、分子分析等方面[14-16]，但對(duì)其性激素季節(jié)性變化方面的研究還很少。本研究選擇內(nèi)蒙古賽罕烏拉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的斑羚為研究對(duì)象，采用放射性免疫分析法(RIA)檢測(cè)斑羚糞便樣品中的睪酮、孕酮、雌二醇，關(guān)注該地區(qū)斑羚糞樣激素水平的季節(jié)性變化趨勢(shì)，并探討造成變化的原因。

1 研究區(qū)域概況

賽罕烏拉國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市巴林右旗北部山地(118°18′～118°55′E，43°59′～44°27′N)，面積為100 446.1 hm2，其中核心區(qū)總面積為16 340.3 hm2，占保護(hù)區(qū)總面積的15.7%；緩沖區(qū)總面積33 750 hm2，占總面積的33.6%；實(shí)驗(yàn)區(qū)總面積為50 355.8 hm2，占總面積的50.7%。氣候?qū)儆诎霛駶?rùn)溫寒氣候，7月份最為炎熱，最高氣溫29℃；1月份最為寒冷，最低氣溫-32℃。年平均降水量400 mm，多集中在6月份至8月份。自然保護(hù)區(qū)山高林密，能夠涵養(yǎng)水源，溝谷河流較多，賽罕烏拉屬大興安嶺南部山地的典型地段，北高南低逐漸向丘陵和平原過(guò)渡，由森林、灌叢過(guò)渡到草原和草甸植被，植物資源非常豐富。豐富的植物資源孕育了豐富的野生動(dòng)物資源，也為斑羚提供了良好的生境[7]。

2 研究方法

2.1 斑羚糞便樣品采集及處理

本研究采用非損傷性取樣方法，基于前期預(yù)調(diào)查結(jié)果，通過(guò)樣點(diǎn)法、樣線法相結(jié)合的方式對(duì)研究區(qū)域所有適宜斑羚生存的地點(diǎn)進(jìn)行搜尋采集。同區(qū)域分布的草食性動(dòng)物除斑羚外，還有狍(Capreoluspygargus)以及東北馬鹿(Cervusxanthopygus)，3種動(dòng)物的糞便在顆粒大小、糞跡類型等方面差異較大，因此區(qū)分不同物種的糞便難度不大。樣品采集時(shí)選取色澤鮮亮的新鮮糞便，采集10～20顆糞粒于一次性自封袋中，記錄每份樣品的采集時(shí)間、GPS位點(diǎn)、區(qū)域位置等信息，加入適量無(wú)水乙醇固定，存入-20℃條件中備用。本研究采樣時(shí)間分別為2015年12月、2016年3月、5月、7月和9月，共采集到斑羚糞便樣品共計(jì)554份，同時(shí)選用了2013年11月份采集的經(jīng)分子方法鑒定已確定性別的樣品，雌雄性樣品各20份[11](表1)。

表1 斑羚糞便樣品數(shù)量統(tǒng)計(jì)

本研究在綜合考慮各種提取方法的優(yōu)劣以后，采用李春等[18]的提取方法，并在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中加以細(xì)微的優(yōu)化，使之能夠有效地適應(yīng)斑羚的糞便樣品，盡量做到有效便捷。具體步驟如下：

1)取糞便樣品2～3粒于研缽中研碎，去除砂礫及粗纖維，取0.5 g于10 mL離心管中；2)加入4 mL甲醇與水的混合溶液(8∶1)，最大渦旋速度震蕩混勻3 min；3)加入2.5 mL石油醚最大渦旋速度震蕩混勻約1 min；4)室溫條件下3500 r/min離心15 min；5)取甲醇層溶液1.5 mL于2 mL離心管中，至于-80℃條件下保存待測(cè)。

2.2 糞便中性激素的檢測(cè)

斑羚糞樣中睪酮(T)、孕酮(P)、雌二醇(E2)的檢測(cè)選用北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的碘[125I]雌二醇(E2)放射免疫分析藥盒，產(chǎn)品批號(hào)分別為國(guó)藥準(zhǔn)字S10940093、國(guó)藥準(zhǔn)字S10940094、國(guó)藥準(zhǔn)字S19973002，檢測(cè)工作由該公司利用XH-6010全自動(dòng)智能γ免疫計(jì)數(shù)器完成,試劑盒檢測(cè)后進(jìn)行聯(lián)機(jī)數(shù)據(jù)處理。

1)聯(lián)機(jī)處理: 使用log-logit或四參數(shù)數(shù)據(jù)處理模式由電腦自動(dòng)處理得出結(jié)果；2)百分結(jié)合率計(jì)算：設(shè)S0管計(jì)數(shù)為B0，各標(biāo)準(zhǔn)管或樣品管計(jì)數(shù)為B，非特異管計(jì)數(shù)為NSB，則百分結(jié)合率計(jì)算公式為B/B0(%)=(B-NSB)/(B0-NSB)×100%；3)logit計(jì)算：各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)或樣品管的logit值計(jì)算公式為logit=ln[(B/B0)/(1-B/B0)]；4)計(jì)算器處理：使用有線性擬合功能的計(jì)算器，計(jì)算出樣品濃度值；5)對(duì)同一時(shí)間即同一批次的樣品濃度值計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)CV(Coefficient of variation)，檢測(cè)所得數(shù)據(jù)的有效性，批內(nèi)變異系數(shù)CV(%)=(標(biāo)準(zhǔn)偏差SD/平均值Mean)×100%，<10%即認(rèn)為所得數(shù)據(jù)為可靠有效數(shù)據(jù)可用作后續(xù)分析[19]。

2.3 數(shù)據(jù)處理

在檢測(cè)這一步驟中，每份樣品均檢測(cè)了睪酮、孕酮及雌二醇3項(xiàng)指標(biāo)，之后數(shù)據(jù)處理時(shí)采用雄激素(睪酮)與雌激素(孕酮+雌二醇)直接對(duì)比初步判定性別的方法，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，將雄激素高的樣品歸為雄性，雌激素高的樣品歸為雌性，以此進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[20]。所得結(jié)果使用SPSS17.0分析，GraphPad Prism 7.0作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 斑羚糞樣中睪酮(T)的檢測(cè)

將所有樣品在數(shù)據(jù)比對(duì)之后初步判定性別的情況下，對(duì)疑似雄性的所有樣品中的睪酮水平加以整理，由睪酮水平的變化趨勢(shì)可知，2016年度睪酮水平峰值出現(xiàn)在7月,為(236.21+23.31)ng/g，水平最低值出現(xiàn)在3月，且3月至7月期間呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，隨即7月出現(xiàn)下降趨勢(shì)。2015年12月至2016年9月各時(shí)間段樣品睪酮檢測(cè)值批內(nèi)變異系數(shù)CV分別為：2.40%、5.96%、9.66%、9.87%和8.9%，數(shù)據(jù)的有限性測(cè)定均在允許范圍之內(nèi)。2013年11月雄性個(gè)體糞便樣品的檢測(cè)結(jié)果，睪酮測(cè)值介于2016年7月與9月之間，相較于其他月份來(lái)看屬于高位水平，且與2015年12月、2016年3月和2016年5月的測(cè)值差異顯著(圖1)。

圖1 睪酮水平變化趨勢(shì)

**表示與2013年11月樣品相比差異極顯著(P<0.01)；下同

3.2 斑羚糞便中孕酮(P)的檢測(cè)

將所有樣品在數(shù)據(jù)比對(duì)之后初步判定性別的情況下，對(duì)疑似雌性的所有樣品中的孕酮水平加以整理，2016年度孕酮水平峰值出現(xiàn)在5月，為(398.24+39.11)ng/g，顯著高于其他各點(diǎn)(Mann-Whitney檢驗(yàn)，P<0.05)。水平最低值出現(xiàn)在3月，且3月至5月期間呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，隨即5月之后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。2015年12月至2016年9月各時(shí)間段樣品孕酮檢測(cè)值批內(nèi)變異系數(shù)CV分別為：9.79%、9.58%、9.82%、9.77%和8.91%，數(shù)據(jù)的有限性測(cè)定均在允許范圍之內(nèi)。2013年11月雌性個(gè)體糞便樣品的孕酮測(cè)值與2016年12月相當(dāng)，與其他月份相比處于低位水平。與2016年5月、7月和9月的測(cè)值差異顯著(圖2)。

3.3 斑羚糞便中雌二醇(E2)的檢測(cè)

由孕酮水平的變化趨勢(shì)將所有樣品在數(shù)據(jù)比對(duì)之后初步判定性別的情況下，對(duì)疑似雌性的所有樣品中的雌二醇水平加以整理，2016年度孕酮水平峰值出現(xiàn)在3月，為(36.36+3.18)ng/g，顯著高于其他各點(diǎn)(Mann-Whitney檢驗(yàn)，P<0.05)。水平最低值出現(xiàn)在7月，且3月至7月期間呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。2015年12月至2016年9月各時(shí)間段樣品雌二醇檢測(cè)值批內(nèi)變異系數(shù)CV分別為：8.47%、8.75%、9.84%、9.81%及9.89%，數(shù)據(jù)的有限性測(cè)定均在允許范圍之內(nèi)。2013年11月雌性個(gè)體糞便樣品的雌二醇測(cè)值與2016年12月相差不大，同樣處于低位水平。與2016年3月的測(cè)值差異顯著(圖3)。

圖2 孕酮水平變化趨勢(shì)

圖3 雌二醇水平變化趨勢(shì)

4 討論

4.1 斑羚糞便性激素變化趨勢(shì)

動(dòng)物性腺激素產(chǎn)生和代謝直接影響著生殖系統(tǒng)的功能運(yùn)轉(zhuǎn)，與動(dòng)物繁殖狀態(tài)密切相關(guān)。睪酮在雄性動(dòng)物繁殖行為中起重要作用，而雌二醇及孕酮在雌性動(dòng)物繁殖活動(dòng)的啟動(dòng)和維持中起重要作用，是雌性發(fā)情的基礎(chǔ)。在孕激素及雌激素的共同作用下，雌性動(dòng)物通過(guò)協(xié)同和拮抗兩種調(diào)節(jié)途徑調(diào)控其生殖生理活動(dòng)[21-25]。

對(duì)于斑羚這一物種的性激素水平研究，目前可供參考的文獻(xiàn)資料寥寥無(wú)幾，僅見(jiàn)在泰國(guó)清邁對(duì)當(dāng)?shù)厝︷B(yǎng)的8只雄性中華斑羚(Naemorhedusgriseus)的雄激素、腎上腺糖皮質(zhì)激素水平的季節(jié)性變化研究[26]。該研究發(fā)現(xiàn)，圈養(yǎng)條件下斑羚的雄激素雨季(5月16日至10月15日)和冬季(10月16日至翌年2月15日)的水平明顯高于夏季(2月16日至5月15日)，且雄激素代謝水平與溫度與日長(zhǎng)成明顯的正相關(guān)關(guān)系；另外，對(duì)于該區(qū)域雌性斑羚的繁殖周期及相應(yīng)的發(fā)情行為的研究發(fā)現(xiàn)，雌性斑羚的發(fā)情周期季節(jié)性不強(qiáng)，發(fā)情周期約為21 d，妊娠期約為7個(gè)月，雌性個(gè)體在此期間不動(dòng)情時(shí)間約為2～5個(gè)月，并且在交配期間翹尾行為會(huì)隨著雌激素的升高而明顯加強(qiáng)[27]。此外，國(guó)內(nèi)對(duì)于圈養(yǎng)條件下的斑羚屬物種赤斑羚(Naemorhedusbaileyi)也有少量研究，謝燕對(duì)上海動(dòng)物園繁殖期的赤斑羚的行為節(jié)律變化與對(duì)應(yīng)的性激素水平進(jìn)行了初步相關(guān)性分析，并沒(méi)有對(duì)赤斑羚整年度性激素水平變化情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)[28]。以上研究均受圈養(yǎng)條件限制，雖然在樣品采集及雌雄性和個(gè)體判定上具有一定的優(yōu)勢(shì)，但是動(dòng)物的激素水平變化受多方面因素影響，如溫度、光照、食物等，相同的物種在不同的地點(diǎn)或者相同的地點(diǎn)不同的年度往往出現(xiàn)差異。這些研究雖然能夠提供一定的關(guān)于斑羚繁殖過(guò)程的信息參考，但對(duì)于野外自然條件下斑羚的繁殖生理情況具有的參考價(jià)值還需要深入探討。

賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū)志中記載，該地區(qū)斑羚發(fā)情期于每年10月，翌年春季4—5月份左右產(chǎn)仔[17]。本研究中斑羚體內(nèi)睪酮水平雖然在7月份出現(xiàn)峰值，但是9月份睪酮水平與2013年11月份的睪酮水平差異不顯著，所以9月份睪酮水平處于一個(gè)高水平狀態(tài)，一定程度上與上述記載一致。針對(duì)7月份出現(xiàn)峰值或許可以從3點(diǎn)原因來(lái)解釋：其一，7月份正處于亞成年個(gè)體快速發(fā)育的時(shí)期，睪酮在雄性個(gè)體中主要起到第二性征的形成和維持、精子發(fā)生的起始和維持、雄性性欲的維持等作用，因此雄性個(gè)體的睪酮水平在此期間出現(xiàn)較高水平。其二，雄性動(dòng)物體內(nèi)的睪酮水平受溫度干擾較大，有些動(dòng)物在溫度較高的情況下體內(nèi)睪酮水平會(huì)出現(xiàn)峰值，這在靈長(zhǎng)類及嚙齒類動(dòng)物中已有相關(guān)結(jié)論[29-30]。賽罕烏拉地區(qū)2016年7月份溫度較高，斑羚體內(nèi)的睪酮水平極有可能隨溫度升高而出現(xiàn)峰值。其三，對(duì)普氏原羚(Procapraprzewalskii)糞便中皮質(zhì)醇激素的保存失效進(jìn)行了研究，結(jié)果表明普氏原羚糞便在-20℃下保存50 d不至引起皮質(zhì)醇含量的變化，但在野外暴露超過(guò)24 h的樣品會(huì)造成測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生誤差[31]。7月保護(hù)區(qū)夏季，氣溫炎熱，不利于糞便在野外狀態(tài)下的保存，本次研究所采樣品相對(duì)都比較新鮮，但是不能完全保證所有的糞便樣品均為24 h內(nèi)采集的，所以7月份的數(shù)據(jù)可能存在一定的誤差，導(dǎo)致出現(xiàn)峰值。

孕酮在雌性個(gè)體中主要起到促進(jìn)生殖道發(fā)育、調(diào)節(jié)發(fā)情、維持妊娠的作用，且低水平的孕酮含量可以促進(jìn)發(fā)情，但高水平的孕酮含量卻能對(duì)抗雌激素的作用，阻止子宮敏感和抑制發(fā)情。孕酮水平的高低一定程度上受食物資源和營(yíng)養(yǎng)狀況的影響，在我國(guó)西北及內(nèi)蒙古地區(qū)，若遇災(zāi)年牧草狀況不好時(shí)，妊娠母山羊胎盤分泌的孕酮較低，導(dǎo)致流產(chǎn)率偏高[32]。斑羚體內(nèi)孕酮水平峰值出現(xiàn)在5月，且3月至5月急劇升高而后至7月出現(xiàn)緩慢下降，這可能是食物資源、妊娠狀態(tài)等多種原因綜合影響的結(jié)果，這種變化趨勢(shì)一定程度上印證了當(dāng)?shù)匚墨I(xiàn)中所記載斑羚的產(chǎn)仔時(shí)間。此外，孕酮除上述維持妊娠等作用外，在哺乳期間也需要較高水平以維持正常的生理功能。

雌二醇在動(dòng)物體內(nèi)主要起到誘導(dǎo)發(fā)情行為、維持動(dòng)物性興奮及促進(jìn)生殖道發(fā)育的功能。斑羚體內(nèi)雌二醇水平在3月出現(xiàn)峰值，7月份水平最低，這一點(diǎn)恰好與同時(shí)期的孕酮水平形成對(duì)比，因?yàn)檩^高水平的孕酮可與雌二醇形成拮抗作用，抑制發(fā)情，此結(jié)果也與泰國(guó)相關(guān)研究中提及的斑羚妊娠期間不動(dòng)情持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的結(jié)論類似[27]。

4.2 選取2013年糞便樣品對(duì)比研究的必要性

本研究中對(duì)于斑羚糞便性激素水平的分析中，選取了2013年11月的樣品對(duì)其中的3項(xiàng)激素水平進(jìn)行了測(cè)試，這部分樣品已經(jīng)做過(guò)性別鑒定[11]，對(duì)其激素水平進(jìn)行檢測(cè)，主要出于以下兩個(gè)方面的考慮。

其一，此前并沒(méi)有對(duì)該地區(qū)斑羚的性激素水平的相關(guān)研究，該區(qū)斑羚性激素的變化情況究竟如何需要本研究提供資料參考。但在野外自然條件下，無(wú)法對(duì)采樣對(duì)象的性別進(jìn)行辨別，本研究亦假設(shè)在樣品性別未知的情況下對(duì)斑羚性激素水平的整體變化情況進(jìn)行探索，所以需要一部分已知性別的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行參考。

其二，通過(guò)對(duì)2013年樣品中性激素水平的檢測(cè)，我們了解到，糞便樣品雖不及血液樣品能夠精準(zhǔn)地反應(yīng)斑羚體內(nèi)的生理狀況，但是由于采樣便捷、儲(chǔ)存容易的特點(diǎn)給研究工作帶來(lái)極大便利，同時(shí)斑羚的糞便樣品在保存了近3年之后其中的激素水平依然能夠檢測(cè)得到，這給后續(xù)的研究工作提供了新思路，可以嘗試采集對(duì)應(yīng)月份的樣品做一次保存時(shí)效的對(duì)比分析。

4.3 試驗(yàn)方法的改進(jìn)

本研究在進(jìn)行伊始即假設(shè)在忽略樣品性別的條件下對(duì)所有采集到的樣品檢測(cè)3項(xiàng)性激素水平，直接分析各項(xiàng)指標(biāo)的月度變化趨勢(shì)。后期處理數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，無(wú)法通過(guò)這種方式獲得良好的結(jié)果，容易造成對(duì)該區(qū)斑羚繁殖生理狀態(tài)的理解偏差。隨后采用將孕酮及雌二醇兩項(xiàng)測(cè)值與睪酮測(cè)值對(duì)比的方式來(lái)初步判定性別，假定雄激素(睪酮)高則表明樣品為雄性，雌激素(孕酮+雌二醇)高則表明樣品為雌性，以此依據(jù)來(lái)分析數(shù)據(jù)，得出如上結(jié)論，在一定程度上解決了野外自然條件下無(wú)法直接判定樣品性別的瓶頸。同時(shí)如果想要更加精準(zhǔn)的驗(yàn)證此方法的可行程度，需要利用分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)確定樣品性別后再進(jìn)一步探討。對(duì)于利用放射性免疫分析法的超微量分析檢測(cè)糞樣性激素濃度各時(shí)間段的相對(duì)值，可免去提取率低以及樣品中殘留的有機(jī)溶劑對(duì)試劑盒標(biāo)記抗原與抗體特異性結(jié)合產(chǎn)生影響的擔(dān)憂[33]。

綜上所述，通過(guò)采集斑羚糞便，利用放射性免疫分析法檢測(cè)其中的性激素，進(jìn)而研究斑羚性激素季節(jié)變化的方法具有可行性強(qiáng)、可靠性高、對(duì)動(dòng)物不構(gòu)成傷害等優(yōu)點(diǎn)，是一種比較理想的實(shí)驗(yàn)方法，但是在采集的時(shí)候也應(yīng)該嚴(yán)格注意糞便的新鮮程度，應(yīng)保證采集的糞便為24 h內(nèi)的新鮮糞便，避免后續(xù)的測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生誤差。