李俊芬 王冬秀 李鵬霞 董川

摘?要?以苦杏仁酸和脯氨酸為碳源和氮摻雜劑，采用一步水熱法合成氮摻雜的藍色熒光水溶性碳點（CDs），通過透射電鏡、紅外光譜、X射線光電子能譜、紫外可見吸收光譜和熒光光譜法等手段進行表征。合成的CDs粒徑均勻，尺寸約為（2.62 ± 0.20） nm，表面存在氨基、羥基、羧基、CC等官能團。最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為360 和450 nm，具有典型的激發(fā)波長依賴性，相對量子產(chǎn)率為7.86%，穩(wěn)定性好?；跓晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移（FRET）原理，CDs的熒光可被Mn有效猝滅。在1～100 μmol/L （即0.055～5.500 mg/L）范圍內(nèi)，Mn 濃度與CDs的熒光猝滅程度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9986，檢出限為0.04 μmol/L （2.20 μg/L），具有高靈敏度和良好的選擇性。此CDs可進入HepG2細胞內(nèi)，發(fā)出藍光，且胞內(nèi)熒光強度與Mn濃度大致呈線性關(guān)系。將此碳點用于環(huán)境水樣和細胞內(nèi)Mn含量的檢測，結(jié)果良好。

關(guān)鍵詞?碳點; 合成; 熒光猝滅; 錳檢測

1?引 言

近年來，碳點（CDs）由于其獨特的光學性質(zhì)和潛在的生物醫(yī)學應(yīng)用價值引起了廣泛關(guān)注[1，2]。 與傳統(tǒng)的金屬量子點（QDs）相比，CDs制備方法簡單、材料廉價、對環(huán)境友好，具有優(yōu)異的熒光性能、化學惰性、水溶性、低毒性和生物相容性[3～5]。CDs顆粒表面含有豐富的羧基、羥基、羰基等官能團，易與離子發(fā)生作用而導致CDs熒光猝滅?；贑Ds的金屬離子熒光探針是光學傳感器領(lǐng)域的研究熱點[6，7]。

錳元素是維持人體健康的主要微量元素，對于組織生長、新陳代謝和抗氧化至關(guān)重要。人體所需Mn主要來自食物和水，過量的Mn可引起神經(jīng)紊亂、DNA突變、極度虛弱，甚至永久性殘疾[8]。因此，準確測定環(huán)境水、土壤、食物和生物樣品中Mn含量很重要[9]。世界衛(wèi)生組織[10]和我國《生活飲用水衛(wèi)生標準》（GB5749-85）[11]規(guī)定水中Mn的最大允許濃度為0.1 mg/L; 我國《食品營養(yǎng)強化劑使用標準》（GB4880-2012）[12]規(guī)定調(diào)制乳粉（兒童用乳粉和孕產(chǎn)婦用乳粉除外）Mn使用量為0.3～4.3 mg/kg。目前，測定Mn含量的方法包括原子吸收光譜法[13]、高效液相色譜法[14]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[15]、溶出伏安法[16]和分光光度法[17]等。這些方法存在一定的局限性，如測定過程復雜、檢測范圍窄、靈敏度低等。而有關(guān)Mn檢測的熒光探針方法的報道很少。Gong等[18]報道了一種基于CDs的環(huán)境水樣和草藥中Mn的檢測方法。因此，建立簡便、靈敏度高、選擇性好的Mn熒光檢測方法非常必要。

CDs的合成方法有水熱合成法、微波輔助法、熱分解法、電化學氧化法等。其中，水熱合成法具有綠色環(huán)保、易于大批量合成的優(yōu)勢，應(yīng)用最廣泛。合成碳點的材料主要分為兩類：天然材料（例如牛奶、大蒜、生物質(zhì)焦油等）和有機分子（如乳糖、檸檬酸、聚乙烯亞胺等）。檸檬酸常作為合成高熒光性能碳點的碳源。如Zhang等[19]以檸檬酸和胺基化合物為原料合成CDs，其熒光量子產(chǎn)率高達99%; Zheng等[20]以檸檬酸和多烯聚胺為原料合成CDs，在CDs表面連接抗癌劑奧沙利鉑，用于癌癥的靶向治療。氨基酸因含有豐富的氨基和羧基而常作為合成CDs的氮摻雜劑?？嘈尤仕崤c檸檬酸同屬于果酸，含碳量達63%，具有良好的抗菌效果，本研究將其作為合成熒光CDs的前體，并以含氮量達12%的脯氨酸為氮摻雜劑，通過水熱法合成水溶性CDs。合成的CDs具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，其熒光可選擇性地被Mn猝滅，可用于水溶液中和細胞內(nèi)Mn的檢測。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

JEM-2100電子顯微鏡（日本電子株式會社）; Nicolet iS50紅外光譜儀（美國Thermo Corporation公司）; Axis Ultra Dld X射線光電子能譜（XPS，英國Axis Ultradld公司）; F-4500熒光分光光度計（日本日立公司）; UV-265紫外-可見分光光度計（日本島津公司）; FLS920愛丁堡全功能型穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀（英國Edinburgh Instruments公司）; LSM880 + Airyscan共聚焦激光掃描顯微鏡（德國Zeiss公司）; pH計（瑞士梅特勒-托利多公司）; ZF-20C暗箱式紫外分析儀（中國寶山顧村電光儀器廠）。

D，L-苦杏仁酸、L-脯氨酸（上海市阿拉丁試劑有限公司）; KMnO4（天津市北辰方正試劑廠）; Dulbecco's modified Eagle's 培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、二甲基亞砜（DMSO）和3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）、青霉素、鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司）。其余試劑均為分析純。所用金屬鹽溶液濃度均為0.1 mol/L， 實驗用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 3～12）采用二次蒸餾水配制。

2.2?CDs的制備

將苦杏仁酸（0.7607 g， 5 mmol）和脯氨酸（0.5757g， 5 mmol）溶于15 mL水中，轉(zhuǎn)移到不銹鋼高壓釜（20 mL）中，在200℃下水熱反應(yīng)5 h[18]。反應(yīng)結(jié)束后， 自然冷卻至室溫，將得到的淺黃色溶液過0.22 μm濾膜除去大顆粒，冷凍干燥， 獲得CDs粉末。

2.3?熒光量子產(chǎn)率（Yu）測量

以硫酸奎寧（Ys為0.54）為參比物[21]，通過式（1）計算CDs的相對熒光量子產(chǎn)率Yu：

其中， u和s分別為CDs和硫酸奎寧的相關(guān)參數(shù)，Y為熒光量子產(chǎn)率，F(xiàn)為積分熒光強度，A為入射光吸光度（≈0.05）， η為溶劑的折射率。

2.4?熒光法檢測Mn

將CDs配成30.00 mg/mL溶液，于4℃保存。在3.00 mL水中，加入40 μL CDs溶液和一定濃度的KMnO4溶液。使用1 cm石英比色皿，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為10 nm，激發(fā)波長為360 nm，發(fā)射波長為450 nm。

2.5?細胞毒性實驗和生物成像

采用MTT方法測定CDs的細胞毒性[22]。將100 μL 5×104 cells/mL的人肝癌組織細胞（HepG2細胞）接種在96孔培養(yǎng)板中。在37℃、 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h。除去原培養(yǎng)基，更換為含不同濃度CDs（0、50、100、200、300、400和500 μg/mL）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。再用含20 μL 5.0 mg/mL MTT的新鮮培養(yǎng)基替換，孵育4 h后， 棄去培養(yǎng)基，并加入100 μL DMSO。振蕩15 min后，使用酶標儀在570 nm波長下測量混合物的吸光度。細胞存活率（Survival rate， SR，%）由式（2）計算得到：

其中，A和A0分別是加入和不加入CDs孔的吸光度值。將HepG2細胞在含有青霉素（100單位/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）及FBS（10%）的DMEM培養(yǎng)基中孵育24 h。加入15 μL CDs（培養(yǎng)基中最終濃度為450 μg/mL）孵育1.0 h后，用0.25%胰蛋白酶-0.020% EDTA混合液溶解未貼壁生長的細胞，再用PBS緩沖溶液（pH 7.4）洗滌3次， 每次1 mL。比色皿中保留1 mL PBS緩沖溶液，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及CDs的熒光強度。向 PBS緩沖溶液中滴加10.0 mmol/L Mn儲備溶液，繼續(xù)觀察細胞形態(tài)及熒光強度，激發(fā)波長為405 nm，發(fā)射波長為460 nm，光譜采集范圍為420～500 nm。

3?結(jié)果與討論

3.1?CDs的結(jié)構(gòu)表征

透射電子顯微鏡（TEM）表征結(jié)果如圖1A和1B所示，CDs呈準球形，在水溶液中均勻分散，無明顯聚集， CDs具有明顯晶格條紋，間距為0.21 nm，對應(yīng)于石墨結(jié)構(gòu)的（002）面[23]; 平均粒徑為（2.62 ± 0.20） nm（圖1C）。

紅外光譜 （圖1D） 顯示，CDs中存在以下官能團： OH/NH （3058 cm1）、CH（2971 cm1和2863 cm1）、CO（1699 cm1）、CC（1598 cm1） 、NH（1549 cm1）、CNH（1371 cm1）和COH（1264、1067和1016 cm1）[24，25]。CDs的X光電子能譜（XPS）圖如圖2A所示，在285、 400和531 eV處的3個特征峰分別對應(yīng)于C1s、N1s和O1s，元素含量比分別為56.36%、12.17%和31.47%。CDs的C1s XPS光譜包含4個峰：284.7 eV（CC）、285.2 eV（CN）、286.5 eV（CO）、288.2 eV（CO）（圖2B）[19]。N1s XPS光譜中399.8、401.3和402.0 eV的峰分別對應(yīng)吡咯氮（CNC）、烷基銨氮（CNH2）和NH基團（圖2C）[26，27]。O1s XPS光譜可以分解為4個峰：530.8、531.7、532.4和533.4 eV，分別對應(yīng)OH、OCO、COH和OCO基團（圖2D）[28]。以上結(jié)果表明，CDs表面存在氨基、羥基、羧基和CC等官能團。

3.2?CDs的光學性質(zhì)考察

如圖3A插圖所示，CDs溶液在365 nm 紫外光激發(fā)下發(fā)出藍光。相對量子產(chǎn)率為7.86%。 由圖3A可見， CDs在258 nm處有明顯吸收峰，歸因于芳香族CC雙鍵發(fā)生的π-π躍遷，并表明芳香雜環(huán)的存在[29]。 CDs的最大激發(fā)波長為360 nm，最大發(fā)射波長為450 nm。如圖3B所示，當激發(fā)波長從300 nm增加至400 nm，發(fā)射峰從400 nm紅移到483 nm， 顯示出激發(fā)波長依賴性[30]，且熒光強度先增加后降低。這可能是 CDs的尺寸粒徑不同或表面發(fā)射位點的數(shù)量、位置不同所致[18]。

3.3?CDs的熒光穩(wěn)定性

考察了儲存時間、溶液pH值、NaCl濃度對CDs穩(wěn)定性的影響。在4℃儲存60天后，CDs溶液仍澄清透明，熒光強度變化很小。隨著溶液pH值升高，CDs在450 nm處熒光強度先逐漸增強后下降，pH=6時，達到最大值。濃度低于2.0 mol/L的NaCl對CDs熒光強度影響不大，表明CDs具有一定的抗鹽能力。

3.4?水溶液中基于CDs的Mn檢測

3.4.1?Mn檢測的選擇性?分析了24種離子對CDs熒光強度的影響。如圖4A所示，加入MnO4后，體系F/F0值（F0和F分別為未加入離子和加入離子后CDs溶液的熒光強度）明顯降低，熒光猝滅效應(yīng)顯著，加入其余離子沒有觀察到明顯的熒光強度變化， 表明CDs對Mn檢測具有良好的選擇性。

3.4.2?響應(yīng)時間的影響?在3.00 mL 水中，加入40 μL CDs，固定KMnO4濃度為100 μmol/L。每隔10 s 檢測混合溶液的熒光強度。由圖4B可見，反應(yīng)20 s時，Mn對CDs的熒光猝滅程度已經(jīng)達到恒定，響應(yīng)時間短。

3.4.3?猝滅機理研究?如圖5A所示，Mn在310、350、530和550 nm附近存在4個寬吸收峰。CDs的最大激發(fā)波長為360 nm，最大發(fā)射波長為450 nm，兩者吸收帶重疊，符合熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）特征[31]。通過雙指數(shù)函數(shù)擬合熒光衰減曲線，如圖5B所示。CDs的平均熒光壽命為6.89 ns，存在兩種不同壽命組分τ1=3.33 ns（51.33%）和τ2=10.65 ns（48.67%）; 加入Mn后，平均熒光壽命減小為5.64 ns，兩種壽命組分分別為τ1=1.81 ns（33.54%）和τ2=7.57 ns（66.46%），表明在熒光猝滅過程中存在電子轉(zhuǎn)移[32]。

3.4.4?基于CDs熒光淬滅檢測Mn的分析性能?如圖6所示，隨Mn濃度的增加，CDs的熒光強度逐漸降低，最大發(fā)射波長藍移。Mn濃度在1～100 μmol/L（即0.055～5.500 mg/L）范圍內(nèi)與CDs的熒光猝滅程度呈線性關(guān)系，線性回歸方程為1 - F/F0=0.0039CMn+ 0.0039，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9986， 檢出限為0.04 μmol/L（即2.20 μg/L），低于世界衛(wèi)生組織和我國《生活飲用水衛(wèi)生標準》規(guī)定的限量濃度（0.1 mg/L， 1.82 μmol/L）。

3.4.5?環(huán)境水樣中Mn的檢測?實際樣品為山西大學校內(nèi)自來水（樣品1）、魚塘水（樣品2）和令德湖水（樣品3），水樣隔夜靜置，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，采用本方法測得各樣品中Mn含量依次為0.0 μg/L（0.0 μmol/L）、2.20 μg/L（0.04 μmol/L）和2.87 μg/L（0.05 μmol/L）。在水樣中分別加入不同濃度的Mn， 測定加標回收率，結(jié)果如表1所示， 回收率為99.6%～109.4%。

3.5?CDs的毒性及其生物成像

采用CDs孵育24 h 的HepG2細胞評估CDs的細胞毒性。如圖7D所示，當CDs濃度達到500 μg/mL時，細胞存活率仍接近90%。此外，激光掃描共聚焦顯微鏡圖像（圖7A～7C）顯示，當用405 nm激光激發(fā)時，被CDs染色的HepG2細胞發(fā)出藍色熒光且保持良好的形態(tài)， 進一步證明CDs生物相容性好，細胞毒性低。 CDs可能通過內(nèi)吞作用，透過細胞膜進入細胞質(zhì)區(qū)域[33]。

3.6?細胞中Mn檢測

將HepG2細胞與CDs（450 μg/mL）在37℃下孵育1 h后，逐滴加入Mn溶液，Mn濃度依次為0、30、100和200 μmol/L，用激光共聚焦顯微鏡觀察。隨著Mn濃度增加，HepG2細胞內(nèi)熒光強度逐漸減弱，形態(tài)保持良好。由圖8可見，HepG2細胞內(nèi)熒光強度與Mn濃度大致呈線性關(guān)系。因此，CDs具有定量或半定量檢測活細胞內(nèi)Mn的潛在用途。

4?結(jié) 論

采用水熱法合成了水溶性CDs?；趯Ds的熒光猝滅效應(yīng)，實現(xiàn)了環(huán)境水樣中Mn的定量檢測。此方法檢出限低、靈敏度高、響應(yīng)快、選擇性好。此外，HepG2細胞的激光共聚焦熒光顯微鏡成像表明，CDs可以作為生物成像的熒光標記物，用于活細胞中Mn含量的檢測。

References

1?Huang Q T， Li Q， Chen Y F， Tong L L， Lin X F， Zhu J J， Tong Q X. Sens. Actuators B， 2018， 276： 82-88

2?Gong P W， Sun L， Wang F， Liu X C， Yan Z Q， Wang M Z， Zhang L， Tian Z Z， Liu Z， You J M. Chem. Eng. J.， ?2019， ?356： 994-1002

3?Huang S， Yang E L， Yao J D， Liu Y， Xiao Q. Anal. Chim. Acta， ?2018， ?1035： 192-202

4??LYU Piao-Piao， XIE Dan-Dan， ZHANG Zhao-Hui. Chinese J. Anal. Chem.， 2018， 46（6）： 917-924

呂飄飄， 謝丹丹， 張朝暉. 分析化學， 2018， 46（6）： 917-924

5?He J H， Cheng Y Y， Yang T， Zou H Y， Huang C Z. Anal. Chim. Acta， ?2018， ?1035： 203-210

6?Wang Y Y， He J， Zheng M D， Qin M D， Wei W. Talanta， ?2019， ?191： 519-525

7?DENG Xiang-Yi， FENG Ya-Li， LI Hao-Ran， DU Zhu-Wei， TENG Qing， KANG Jin-Xing， WANG Hong-Jun. Chinese J. Anal. Chem.， ?2017， ?45（10）： 1497-1503

鄧祥意， 馮雅麗， 李浩然， 杜竹瑋， 滕 青， 康金星， 王洪君. 分析化學， 2017， ?45（10）： 1497-1503

8?Deng P， Lu L Q， Cao W C， Tian X K. Spectrochim. Acta， ?2017， ?173： 578-583

9?Ahmed M J， Islam M T， Hossain F. RSC Adv.， ?2018， ?8（10）： 5509-5522

10?WHO/SDE/WSH/03.04/104/Rev/1， Manganese in Drinking-water Background Document for Development of WHO Guidelines for Drinking-water Quality. World Health Organization

11?GB5749-85， Sanitary Standard for Drinking Water. National Standards of the People's Republic of China

生活飲用水衛(wèi)生標準. 中華人民共和國國家標準. GB5749-85

12?GB 14880-2012， Use Standard for Food Nutrition Enhancer. National Standards of the People's Republic of China

食品營養(yǎng)強化劑使用標準. 中華人民共和國國家標準. GB 14880-2012

13?Tobiasz A， Soltys M， Kurys E， Domagaa K， Dudek-Adamska D， Walas S. Spectrochim. Acta B， ?2017， ?134： 11-16

14?Zou D Q， Qing Y， Li Y T， Liu M S， Yang Y L. J. Iran. Chem. Soc.， ?2014， ?11（2）： 415-422

15?Chen S Z， Zhu L， Chen X L， Wang X， Zhou X R. Atom. Spectrosc.， ?2011， ?32（1）： 12-16

16?Khoo S B， Soh M K， Cai Q T， Khan M R， Guo S X. Electroanalalysis， ?1997， ?9（1）： 45-51

17?Kostova D. Russ. J. Inorg. Chem.， ?2011， ?56（6）： 968-974

18?Gong X J， Li Z B， Hu Q， Zhou R X， Shuang S M， Dong C. ACS Appl. Mater. Interfaces， ?2017， ?9（44）： 38761-38772

19?Zhang Y Q， Liu X Y， Fan Y， Guo X Y， Zhou L， Lv Y， Lin J. Nanoscale， ?2016， ?8（33）： 15281-15287

20?Zheng M， Liu S， Li J， Qu D， Zhao H F， Guan X G， Hu X L， Xie Z G， Jing X B， Sun Z C. Adv. Mater.， ?2014， ?26（21）： 3554-3560

21?Amin N， Afkhami A， Hosseinzadeh L， Madrakian T. Anal. Chim. Acta， ?2018， ?1030： 183-193

22?Li Z H， Guo S， Yuan Z Q， Lu C. Sens. Actuators B， ?2017， ?241： 821-827

23?Li S H， Jiang J， Yan Y N， Wang P， Huang G， Kim N H， Lee J H， He D N. Mater. Sci. Eng. C， ?2018， ?93： 1054-1063

24?Gong X J， Lu W J， Liu Y， Li Z B， Shuang S M， Dong C， Choi M M F. J. Mater. Chem. B， ?2015， ?3（33）： 6813-6819

25?Li J F， Zhang L， Li P X， Zhang Y， Dong C. Sens. Actuators B， ?2017， ?248： 92-100

26?Zheng A Q， Wang N， Chen M L， Shu Y， Wang J H. Talanta， ?2018， ?188： 788-794

27?Chen X X， Jin Q Q， Wu L Z， Tung C H， Tang X J. Angew. Chem. Int. Edit.， ?2014， ?53（46）： 12542-12547

28?Dong Y Q， Pang H C， Yang H B， Guo C X， Shao J W， Chi Y W， Li C M， Yu T. Angew. Chem. Int. Edit.， ?2013， ?52（30）： 7800-7804

29?Borse V， Thakur M， Sengupta S， Srivastava R. Sens. Actuators B， ?2017， ?248： 481-492

30?Yan F Y， Bai Z J， Chen Y， Zu F L， Xing L X， Xu J X， Chen L. Sens. Actuators B， ?2018， ?275： 86-94

31?Yuan Y S， Jiang J Z， Liu S P， Yang J D， Zhang H， Yan J J， Hu X L. Sens. Actuators B， ?2017， ?242： 545-553

32?Mhetear Tuerhong， XU Yang， YIN Xue-Bo. Chinese J. Anal. Chem.， ?2017， ?45（1）： 139-150

木合塔爾·吐爾洪， 徐 陽， 尹學博. 分析化學， 2017， ?45（1）： 139-150

33?Zhang J， Yu S H. Mater. Today， ?2016， ?19（7）： 382-393