張禾蓉 易達(dá) 孟子暉 薛敏 汪海林 馮金生

摘?要?采用乳液聚合法，在水相中制備了一系列納米水凝膠顆粒（NPs），基于動(dòng)態(tài)涂層法應(yīng)用于毛細(xì)管電泳分離DNA片段。動(dòng)態(tài)光散射表征結(jié)果表明，所制備的NPs分散性好、粒徑分布均勻。基于NPs交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)將其作為毛細(xì)管電泳分離介質(zhì)，結(jié)果表明，單體的用量、納米顆粒的粒徑以及NPs在毛細(xì)管電泳中的濃度對(duì)DNA分離效果都有影響。當(dāng)單體采用N-異丙基丙烯酰胺（87%）、丙烯酸羥乙酯（8%）和丙烯酸（4%），交聯(lián)劑為N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺（1%）時(shí)，通過(guò)改變表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS）的用量，可以改變所制備的納米顆粒粒徑，當(dāng)SDS用量為53 mg時(shí)，NPs粒徑約480 nm。將此NPs（8.0 mg/mL）加入TG緩沖溶液（25 mmol/L Tris，192 mmol/L甘氨酸，pH 8.3）用于毛細(xì)管電泳，3個(gè)長(zhǎng)度DNA片段（20、50和80 nt）可實(shí)現(xiàn)完全分離，分離效果好，且遷移時(shí)間較短。

關(guān)鍵詞?納米水凝膠顆粒; 毛細(xì)管電泳; DNA分離

1?引 言

毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis， CE）是以熔融石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分析技術(shù)[1]，具有高效、高分辨率、高靈敏度等特性，在核酸、多肽、蛋白質(zhì)等生物大分子的分離分析中應(yīng)用廣泛[2～4]。CE用于DNA分析時(shí)，通過(guò)在毛細(xì)管柱中充入凝膠或聚合物溶液等篩分介質(zhì)形成凝膠色譜柱，依據(jù)DNA片段大小和形狀可以在電泳過(guò)程中實(shí)現(xiàn)篩分分離[5]。這種凝膠毛細(xì)管柱雖然分離效率較高，但是高粘度交聯(lián)的聚合物會(huì)導(dǎo)致毛細(xì)管柱難以制備和維護(hù)，近年報(bào)道的親水性聚合物溶液篩分體系的應(yīng)用，很好地解決了這個(gè)問(wèn)題[6]。 Heiger等[7]率先將線性聚丙烯酰胺（Linear polyacrylamide，LPA）用于CE分離DNA，實(shí)現(xiàn)了片段長(zhǎng)度達(dá)12000的堿基對(duì)的雙鏈DNA的高效分離。然而，LPA溶液的粘度較高，而且使用LPA溶液時(shí)，必須通過(guò)化學(xué)衍生的方法在毛細(xì)管內(nèi)壁形成一層LPA聚合物涂層，減少DNA片段在毛細(xì)管內(nèi)壁上的吸附以及抑制電滲流（EOF）[8]。這種共價(jià)涂層毛細(xì)管制備比較復(fù)雜，使用壽命短，且難沖洗。研究表明，一些聚合物溶液能夠形成比較穩(wěn)定的動(dòng)力學(xué)涂層，可用于分離DNA，其機(jī)理是通過(guò)聚合物溶液和毛細(xì)管內(nèi)壁之間的相互作用（如氫鍵、疏水作用以及靜電作用等）形成的一種物理吸附[9]。常用的聚合物包括聚二甲基丙烯酰胺（PDMA）、聚環(huán)氧乙烯（PEO）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。Gao等[10]合成了一種新型的星狀PDMA，將其作為基質(zhì)用于DNA分離，與線性聚合物相比，該聚合物提高了篩分能力，縮短了分離時(shí)間，獲得了較好的分離性能。李玉榮等[11]以PEO為篩分介質(zhì)，采用硅烷化處理的毛細(xì)管柱分離100～5000 bp DNA片段。Gao等[12]在單色測(cè)序分離時(shí)，采用濃度為7% 的PVP溶液分離了350 bp的DNA 片段。這類具有高親水性、良好的溶解能力且能夠形成動(dòng)態(tài)涂層的分離介質(zhì)，雖然可以成功地實(shí)現(xiàn)DNA分離，但是由于聚合物溶液的粘度太大[13]，導(dǎo)致了毛細(xì)管柱難沖洗。

近年來(lái)，納米顆粒聚合物[14]、二氧化硅納米顆粒[15]、金納米顆粒[16]?等作為復(fù)合分離介質(zhì)，已成功用于分離DNA[17]和蛋白質(zhì)[18]?；谄涑叽缧?yīng)獨(dú)特、表面作用位點(diǎn)多、選擇性高、生物相容性好等物化性質(zhì)，這些納米顆粒分離介質(zhì)雖可成功分離DNA和蛋白質(zhì)，但實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣，不易制備和使用。親水性是影響聚合物溶液動(dòng)態(tài)涂層能力和篩分性能的關(guān)鍵因素之一[19]，N-異丙基丙烯酰胺（NIPAm） 具有親水的酰胺基團(tuán)，將其聚合物用于CE，實(shí)現(xiàn)了雙鏈DNA和質(zhì)粒DNA的分離[20]。以NIPAm單體為基質(zhì)的納米水凝膠顆粒（Nanoparticles hydrogel， NPs）是一種能在水中顯著溶脹，但不能溶解的親水性聚合物，具有很高的含水量，與生物組織類似，具有良好的生物相容性，近年來(lái)，在藥物輸送與釋放[21]、蛋白質(zhì)識(shí)別[22]、醫(yī)學(xué)診斷[23]等生物領(lǐng)域中顯示了良好的應(yīng)用前景。由于NPs內(nèi)部具有交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此其穩(wěn)定性高于聚合物膠束、聚合物囊泡等聚合物納米粒子[24]。

本研究基于NIPAm的親水性及納米顆粒的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成了一系列以NIPAm為基質(zhì)的納米水凝膠顆粒，將其作為毛細(xì)管電泳分離介質(zhì)分離DNA。考慮到在較寬的生理和病理過(guò)程范圍內(nèi)，較短的DNA 片段對(duì)人類的基因表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用[25]，實(shí)驗(yàn)選取了20、50和80 nt的DNA片段。通過(guò)改變聚合單體和配方，優(yōu)化分離效果，并探究NPs在DNA分離中的應(yīng)用可能性以及分離機(jī)理。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

Zetasizer Nano-ZS動(dòng)態(tài)光散射粒度儀（馬爾文（中國(guó)）有限公司）; JSM-7500掃描電鏡（SEM，荷蘭PHILIPS CZECH公司）; 毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光分析（CE-LIF）儀器裝置為實(shí)驗(yàn)室自制[26]。熔融石英毛細(xì)管（o.d. 365 μm; i.d. 25 μm， 永年縣銳灃色譜器件有限公司）。

丙烯酸（AAc，99%）、N-異丙基丙烯酰胺（NIPAm，99%）、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺（BIS，98%）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，99%）、甘氨酸（98%）（北京百靈威科技有限公司）; 丙烯酸羥乙酯（HEAc，99%，阿拉丁試劑有限公司）; 十二烷基硫酸鈉（SDS，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）; 過(guò)硫酸銨（APS，分析純，北京化工廠）; DNA（T×20、T×50、T×80，99%，生工生物工程有限公司）。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（艾科浦純水系統(tǒng)AWL-0502-U， 重慶臺(tái)浦有限公司）。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?納米水凝膠顆粒的制備?采用乳液聚合法制備納米水凝膠顆粒[27]。將NIPAm（（95-X） mol%）、 AAc（4 mol%）、 BIS（1 mol%）、 SDS（53 mg）溶于120 mL去離子水中，然后加入HEAc（X mol%），在室溫下通N2除氧，磁力攪拌反應(yīng)120 min; 將反應(yīng)溫度升至70℃，在N2保護(hù)下反應(yīng)40 min; 取APS（83 mg APS溶于12 mL水中）加入上述溶液中，持續(xù)通氮?dú)獠⒈３謹(jǐn)嚢锠顟B(tài)，反應(yīng)4 h（圖1）。將反應(yīng)后所得聚合物溶液裝入透析袋（MWCO≤14000 Da）中透析純化5天，除去殘留的反應(yīng)物原料和表面活性劑。

2.2.2?毛細(xì)管電泳分離DNA實(shí)驗(yàn)?截取37 cm、內(nèi)徑為25 μm的未涂層毛細(xì)管裸管（從進(jìn)樣口到檢測(cè)窗口距離30 cm），使用前用0.1 mol/L NaOH沖洗2 h。應(yīng)用分離電壓為+20 kV，電動(dòng)進(jìn)樣5 s（電壓為+15 kV）。運(yùn)行緩沖溶液為TG溶液（25 mmol/L Tris，192 mmol/L甘氨酸，pH 8.3）中加入一定濃度的NPs，樣品緩沖溶液為Tris-HCl溶液（50 mmol/L，pH 7.5）。所有的分離都在室溫下進(jìn)行，每次分析后，毛細(xì)管依次使用0.02 mol/L NaOH沖洗5 min、水沖洗2 min、緩沖液沖洗5 min。

3?結(jié)果與討論

3.1?納米水凝膠顆粒的表征

納米水凝膠顆粒（NPs）采用3種單體NIPAm、HEAc和AAc共聚而成，通過(guò)改變配方，制備了一系列NPs，并經(jīng)DLS檢測(cè)，獲得其粒徑、分散性、表面電動(dòng)勢(shì)等性質(zhì)（表1）。

由表1可見，通過(guò)改變聚合物配方，獲得了粒徑和表面電動(dòng)勢(shì)均不同的NPs，且HEAc用量越大，表面電動(dòng)勢(shì)絕對(duì)值越高。所制備的聚合物納米小球分散指數(shù)PDI<0.2，分散性良好。DLS檢測(cè)結(jié)果（圖2）表明，NPs粒徑分布均勻。

3.2?NPs制備中HEAc用量對(duì)DNA分離效果的影響

通常，熔融石英毛細(xì)管內(nèi)壁帶負(fù)電，在貼近管壁的液體表面會(huì)形成一個(gè)帶正電荷的離子層，將所制備的NPs加入毛細(xì)管電泳運(yùn)行緩沖溶液時(shí)，帶負(fù)電基團(tuán)的聚合物顆粒可通過(guò)靜電作用吸附在毛細(xì)管內(nèi)壁上形成吸附涂層，起到抑制電滲流和DNA的吸附作用。在NPs制備中，HEAC單體提供負(fù)電荷，由表1可見，控制AAc摩爾百分比不變，HEAc用量從0增加至24%時(shí)， NPs表面電動(dòng)勢(shì)為負(fù)值，絕對(duì)值從4.99增加到6.79。

將8.0 mg/mL NPs分別加入到運(yùn)行緩沖溶液TG中，配制成不同的篩分介質(zhì)，考察基于不同HEAC用量制備的NPs對(duì)3個(gè)不同片段DNA的分離效果。如圖3所示，采用4種NPs作為復(fù)合分離介質(zhì)加入運(yùn)行緩沖溶液分離目標(biāo)DNA，在3 min之內(nèi)均完成實(shí)驗(yàn)。其中，采用NP1、NP3以及NP4的分離效果較差，而采用NP2的運(yùn)行緩沖溶液對(duì)3個(gè)DNA片段基本實(shí)現(xiàn)了基線分離。這是由于當(dāng)帶負(fù)電荷的HEAc摩爾百分比增加時(shí)，所制備的NPs電荷斥力增強(qiáng)，帶負(fù)電基團(tuán)的NPs表面電動(dòng)勢(shì)絕對(duì)值越大，通過(guò)靜電作用在毛細(xì)管內(nèi)壁上形成的吸附涂層越穩(wěn)定，使得其分離度增大，但是電荷斥力過(guò)強(qiáng)，可能導(dǎo)致NPs自身相互排斥，削弱涂層的吸附能力。

3.3?NPs粒徑對(duì)DNA分離效果的影響

考察了NPs粒徑大小對(duì)DNA的分離效果。在NPs制備過(guò)程中，保持其它條件不變，通過(guò)改變SDS用量（5、25和53 mg），制備得到不同粒徑的NPs（650、600和480 nm），此結(jié)果與文獻(xiàn)[28]相符。將這3種NPs分別加入緩沖溶液分離DNA，分離效果如圖4所示，可見隨著NPs粒徑減小， DNA的分離效果有所提高。推測(cè)可能是因?yàn)榱叫〉腘Ps具有較大的比表面積，且形成了合適的篩分網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對(duì)不同的DNA片段產(chǎn)生的阻礙作用不同; 而粒徑較大的NPs形成的篩分網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不能有效分離不同片段的DNA，而且粒徑較大的NPs分散性較差，容易團(tuán)聚。

3.4運(yùn)行緩沖溶液中NPs的濃度對(duì)DNA分離效果的影響

根據(jù)上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在運(yùn)行緩沖溶液TG中加入不同濃度的NP2，對(duì)3個(gè)不同片段DNA的分離效果如圖5所示。

由圖5A可見，空白實(shí)驗(yàn)僅采用運(yùn)行緩沖溶液TG，不加入任何NPs，此時(shí)，3個(gè)片段DNA完全無(wú)法分離; 通過(guò)改變NPs加入量，分離效果有所改善; 當(dāng)NPs濃度為8.0 mg/mL時(shí)（圖5C），3個(gè)DNA片段實(shí)現(xiàn)了基線分離。這是因?yàn)橐噪姖B流（EOF）為驅(qū)動(dòng)力的電泳過(guò)程分離DNA是根據(jù)其大小和形狀進(jìn)行篩分的，因此，具有高親水性、良好的篩分能力以及動(dòng)態(tài)涂層能力的聚合物水溶液通過(guò)吸附在毛細(xì)管內(nèi)壁，形成相對(duì)穩(wěn)定的動(dòng)力學(xué)涂層，可抑制電滲流（EOF）及DNA 片斷和毛細(xì)管管壁的吸附作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA片段的篩分。本研究中，增加聚合物濃度相當(dāng)于增大了聚合物鏈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而形成了微孔篩分聚合物網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)NPs濃度較低時(shí)，沒有形成動(dòng)態(tài)的物理網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，分離性能不佳。隨著NPs濃度增加，聚合物鏈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增大，當(dāng)NPs濃度為8.0 mg/mL時(shí)，各片段DNA按大小依次通過(guò)篩孔實(shí)現(xiàn)分離。當(dāng)NPs的濃度繼續(xù)增大時(shí)，聚合物鏈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)緊密，形成的篩分孔徑減小，增大了DNA的遷移阻力，使得分離度減小。

3.5?NPs分離DNA的作用機(jī)理探討

為了更好地理解NPs作為復(fù)合分離介質(zhì)對(duì)DNA分離效果的影響，實(shí)驗(yàn)時(shí)將NPs灌入毛細(xì)管，采用掃描電鏡（SEM）觀測(cè)毛細(xì)管中NPs存在形式（圖6）。

由圖6可見，毛細(xì)管內(nèi)壁吸附了一層或者多層NPs。由于NPs表面具有大量羥基，與毛細(xì)管內(nèi)壁上的硅羥基形成氫鍵，同時(shí)，NPs帶負(fù)電荷，與管壁正電荷離子層結(jié)合。NPs在管壁的吸附，降低了毛細(xì)管內(nèi)壁與DNA間的作用，有效地抑制了DNA 片斷在毛細(xì)管內(nèi)壁上的吸附，對(duì)毛細(xì)管起到了涂層作用。DNA分離過(guò)程采用的運(yùn)行緩沖溶液由TG和親水性NPs構(gòu)成，使得NPs在毛細(xì)管內(nèi)壁涂層形成過(guò)程動(dòng)態(tài)可逆，動(dòng)態(tài)涂層易于形成和再生，最終實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)平衡[29]。

近年來(lái)，二氧化硅納米顆粒、金納米顆粒等已成功用于CE分離DNA和蛋白質(zhì)，相比這些納米材料，本研究所制備的納米水凝膠顆粒易于合成，且不需要作為固定相提前加入毛細(xì)管柱，可直接加入緩沖溶液實(shí)現(xiàn)分離，操作簡(jiǎn)單， 不易堵塞毛細(xì)管柱。

本研究制備的NPs以溫敏性單體NIPAm作為結(jié)構(gòu)框架，因此具有溫敏性[30]，在較低臨界溶解溫度（LCST）下發(fā)生相轉(zhuǎn)變。當(dāng)溶液溫度低于LCST時(shí)，NPs的親水部分與水分子間氫鍵作用占主導(dǎo)地位，凝膠網(wǎng)絡(luò)外圍將形成一種由氫鍵為主要作用力且高度有序的溶劑殼層，而形成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定和網(wǎng)孔大小均一的物理網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。當(dāng)外界溫度高于LCST時(shí)，凝膠分子的疏水作用加強(qiáng)，形成的疏水層破壞了外圍的氫鍵作用與溶劑殼層，溫度升高至LCST時(shí)水分子從凝膠中排出，因此發(fā)生了由線團(tuán)到球形結(jié)構(gòu)的構(gòu)像轉(zhuǎn)變[31]，如圖7所示。

當(dāng)環(huán)境溫度低于LCST時(shí)，NPs發(fā)生溶脹，溶液較清澈，高于LCST時(shí)，NPs收縮為粒徑較小的納米小球，溶液比較渾濁（圖7）。在毛細(xì)管聚合物溶液電泳中，DNA的分離性能很大程度上取決于篩分聚合物的物理性質(zhì)[32]，因此，緩沖溶液中NPs的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成的空間結(jié)構(gòu)與分離效果密切相關(guān)。當(dāng)DNA片段遷移時(shí)，核酸分子碰撞進(jìn)入水凝膠溶液的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，較大的分子片段只能進(jìn)入孔徑較大的凝膠孔隙內(nèi)，而較小分子片段可進(jìn)入較多的凝膠顆粒內(nèi)。大分子片段在凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中移動(dòng)的距離較短，較小片段分子的移動(dòng)距離較長(zhǎng)， 當(dāng)NPs形成了有效的篩分網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)時(shí)，即可對(duì)不同片段的DNA實(shí)現(xiàn)分離。

4?結(jié) 論

采用乳液聚合法，通過(guò)調(diào)整合成配方，得到一系列具有交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且粒徑均勻可調(diào)的納米水凝膠顆粒，并將其用于毛細(xì)管電泳分離DNA。通過(guò)考察納米水凝膠顆粒的單體配比、粒徑大小及濃度對(duì)DNA分離效果的影響，得到分離DNA的最優(yōu)配方。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納米水凝膠顆粒具有高親水性、良好的篩分性能、穩(wěn)定性以及生物友好性等優(yōu)點(diǎn)，濃度低，易于制備和使用，是一種比較理想的篩分介質(zhì)，在毛細(xì)管電泳對(duì)DNA及其它生物大分子的分離中具有良好的應(yīng)用前景。

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