趙秀真

（山東省菏澤市第二人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 菏澤 274000）

宮頸癌是婦科的三大惡性腫瘤之一，大多數(shù)宮頸癌出現(xiàn)的主要病因為感染高危型人乳頭狀瘤病毒（high-risk human papillomavirus,hr-HPV）[1]。惡性腫瘤發(fā)生進展中起到主要作用的為腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME），其中大量炎性細胞浸潤引發(fā)腫瘤相關(guān)性炎癥是導(dǎo)致腫瘤細胞發(fā)生的第七大標(biāo)志，腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor associated macrophages,TAMs）與腫瘤細胞的預(yù)后、進展、發(fā)生密切相關(guān)[2]。腫瘤相關(guān)巨噬細胞是評估惡性腫瘤預(yù)后的客觀指標(biāo)之一，可從各個方面對腫瘤組織的轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖能力產(chǎn)生影響。腫瘤巨噬細胞包含多個分子標(biāo)記物，有研究發(fā)現(xiàn)，分子標(biāo)記物可反映單核巨噬細胞的功能狀態(tài)。本研究探析感染高危型人乳頭狀瘤病毒（hr-HPV）相關(guān)宮頸癌的發(fā)生、進展與腫瘤相關(guān)巨噬細胞的相關(guān)性，效果滿意，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

臨床選擇2016年5月-2017年3月本院的宮頸組織標(biāo)本130例。其中宮頸正常組織標(biāo)本20 例，宮頸癌根治性子宮切除手術(shù)38例，宮頸冷刀錐切手術(shù)20例，宮頸環(huán)切手術(shù)26例，宮頸活檢組織6例，子宮肌瘤子宮全切手術(shù)20例。病理分期：鱗狀上皮細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen,SCC）（I～IIa期）30例，宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）II～III 期組織42例，CIN I期組織38例。排除標(biāo)準(zhǔn)：宮頸癌根治性手術(shù)前后接受化學(xué)療法、放射療法等非手術(shù)治療患者、宮頸腺癌患者、急性盆腔感染患者?；颊叩牧馨娃D(zhuǎn)移情況、組織學(xué)分型、國際婦產(chǎn)聯(lián)合會（International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO）分期、年齡、HPV感染狀況均來源于本院婦產(chǎn)科。全部患者均自愿參加本研究，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。患者檢測HPV感染方式為第二代雜交捕獲法（hybrid capture 2,HC2），少數(shù)為HPV分型檢測結(jié)果。病理科主任醫(yī)師審核全部病理資料。

1.2 試劑

中杉金橋公司提供的免疫組織二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine,DAB）顯色試劑盒和免疫組織化學(xué)檢測試劑盒，美國Abcam提供CD163小鼠抗人單克隆抗體。

1.3 方法

組織中CD163巨噬細胞應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測，福爾馬林中固定組織標(biāo)本，應(yīng)用石蠟包埋，連續(xù)切片5 μm。脫蠟水化組織切片，置于室溫環(huán)境下混合3%的雙氧水-甲醇孵育30 min，將其內(nèi)源性過氧化物酶活性除去。置于微波爐內(nèi)，加入pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液，修復(fù)抗原15 min。在37℃用10%山羊血清封閉。1∶200的一抗稀釋液稀釋CD163小鼠抗人單克隆抗體，置于4℃冰箱內(nèi)過夜。在37℃二抗和切片一同孵育30 min，DAB顯色60 s，蘇木素復(fù)染。二甲苯透明，梯度酒精脫水，風(fēng)干后應(yīng)用中性樹脂封片固定。冷凍切片7 μm在室溫下晾干，4℃冷丙酮固定30 min，分別予以10%的正常兔血清、3%的雙氧水封閉非特異性染色。然后滴加1∶100稀釋的兔抗小鼠CD204、兔抗小鼠CD68，37℃孵育40 min，滴加1∶400生物素化的山羊抗兔IgG工作液及1∶400辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育40 min，DAB顯色，鏡檢，保存圖像。

1.4 腫瘤相關(guān)巨噬細胞的分子標(biāo)記物計數(shù)和表達量評分

由兩位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師雙盲閱片，巨噬細胞膜上表達CD163，應(yīng)用低倍鏡（×100）篩選CD163樣本，CD163的表達呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀，進一步分析密集區(qū)的棕黃色細胞比率，在高倍鏡下（×400）隨機選擇5個視野的巨噬細胞的平均數(shù)量，按照棕黃色細胞所占比率，評估巨噬細胞CD163的表達量（0～3分），低于5%為0分，5%～20%為1分，20%～50%為2分，超過50%為3分，高水平表達為2～3分，低水平表達為0～1分。隨機選擇橫切面5個，光鏡下隨機選擇子宮橫切面的外膜、肌層、內(nèi)膜視野20個（10×20倍），對每個視野內(nèi)的陽性細胞數(shù)目進行統(tǒng)計，檢測免疫組化陽性細胞灰度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理分析

全部數(shù)據(jù)進行SPSS 20.0軟件系統(tǒng)處理分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料用例（%）表示，比較進行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同惡性程度的宮頸癌患者的腫瘤相關(guān)巨噬細胞CD163、CD204、CD68等分子標(biāo)記物的表達水平

宮頸癌 SCC（I～IIa期）的 CD163、CD204、CD68等分子標(biāo)記物的表達水平顯著高于CIN II～III期、CIN I期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），宮頸癌 CIN II～III期的 CD163、CD204、CD68等分子標(biāo)記物的表達水平顯著高于宮頸癌CIN I期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 不同惡性程度的宮頸癌患者發(fā)生hr-HPV感染及腫瘤轉(zhuǎn)移情況分析

宮頸癌SCC（I～IIa期）發(fā)生hr-HPV感染及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況顯著高于CIN II～III期、CIN I期，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），宮頸癌CIN II～III期發(fā)生hr-HPV感染及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況顯著高于宮頸癌CIN I期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 宮頸癌不同惡性程度中巨噬細胞CD163的表達情況

CD163主要表達于巨噬細胞的細胞膜上，呈棕黃色顆粒狀，正常宮頸組織組CD163+計數(shù)均值為（5.4±0.3）,CIN I期為（39.2±2.4）,CIN II～III組為（69.5±3.6），SCC組為（133.2±5.8），隨著宮頸組織惡性進展，CD163+巨噬細胞的表達呈逐漸上升趨勢。見圖1。

表1 不同惡性程度的宮頸癌患者的腫瘤相關(guān)巨噬細胞CD163、CD204、CD68等分子標(biāo)記物的表達水平（±s，%）

表1 不同惡性程度的宮頸癌患者的腫瘤相關(guān)巨噬細胞CD163、CD204、CD68等分子標(biāo)記物的表達水平（±s，%）

注：t1/P1為宮頸癌SCC（I～IIa期）與CIN II～III期比較，t2/P2為宮頸癌SCC（I～IIa期）與CIN Ⅰ期比較，t3/P3為CIN II～III期與CIN I期比較。

組別 例數(shù) CD163 CD204 CD68宮頸癌 SCC ( I～IIa 期 ) 30 135.7±11.3 145.7±10.6 134.6±11.3 CIN II～III期 42 76.5±6.5 85.6±7.9 86.7±7.6 CIN I期 38 34.6±3.2 48.7±5.4 34.5±6.2 t1/P1 28.10/0.000 27.58/0.001 21.52/0.000 t2/P2 52.64/0.000 48.99/0.000 46.51/0.000 t3/P3 35.97/0.001 24.13/0.000 33.45/0.001

表2 不同惡性程度的宮頸癌患者的發(fā)生hr-HPV感染及腫瘤轉(zhuǎn)移情況分析 例（%）

圖1 CD163+巨噬細胞在宮頸組織切片中的表達情況（×400）

3 討論

目前，較多發(fā)達國家應(yīng)用巴氏檢查或常規(guī)細胞學(xué)檢查法降低宮頸癌的發(fā)病率[3]。約有99%的宮頸癌患者與人乳頭狀高危型病毒密切相關(guān)（hr-HPV）[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，從最初感染人乳頭狀高危型病毒到進展為宮頸癌最少不低于8年，hr-HPV陰性的女性在5～7年內(nèi)不會進展為宮頸癌[5]。研究指出半年后再次進行細胞學(xué)檢查只檢測到部分高級別宮頸鱗狀上皮病變[6]。其中約有三分之一的高級別宮頸鱗狀上皮病變持續(xù)感染最終診斷為人乳頭狀高危型病毒，人乳頭狀高危型病毒多次檢測或重復(fù)細胞學(xué)檢驗對于陰道鏡轉(zhuǎn)診率的下降效果不佳[7]。目前，臨床醫(yī)學(xué)已應(yīng)用新型輔助檢查方式提高宮頸癌及其癌前病變檢查的準(zhǔn)確性[8]。有已經(jīng)發(fā)生癌變的或出現(xiàn)癌變趨勢的細胞核酸增生異常，在細胞形態(tài)出現(xiàn)變化之前已經(jīng)出現(xiàn)了核酸變化[9]。宮頸上皮DNA非整倍體缺少可用于評估臨床預(yù)后。以往文獻發(fā)現(xiàn)檢測DNA倍體的陽性預(yù)測值具有一定的差異性，可能與標(biāo)本的數(shù)量、標(biāo)本的選擇密切相關(guān)[10]。

本研究探析感染高危型人乳頭狀瘤病毒（hr-HPV）相關(guān)宮頸癌的發(fā)生、進展與腫瘤相關(guān)巨噬細胞的相關(guān)性，結(jié)果顯示：宮頸癌SCC（I～IIa 期）的 CD163、CD204、CD68等分子標(biāo)記物的表達水平顯著高于CIN II～III期、CIN I期，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），宮頸癌CIN II～III期的 CD163、CD204、CD68等分子標(biāo)記物的表達水平顯著高于宮頸癌CIN I期，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。宮頸癌SCC（I～IIa期）發(fā)生hr-HPV感染及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況顯著高于CIN II～III期、CIN I期，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），宮頸癌 CIN II～III期的發(fā)生 hr-HPV感染及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況顯著高于宮頸癌CIN I期，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與Canfell等[11]的研究結(jié)果大體一致，宮頸癌由最初的感染高危型人乳頭狀瘤病毒至癌前病變、浸潤癌最少需要10～15年，說明感染高危型人乳頭狀瘤病毒僅是始動因子，腫瘤微環(huán)境中的浸潤炎性細胞、血管、基質(zhì)的變化、惡性腫瘤細胞的遺傳變化等因素決定了腫瘤的生長。研究表明，感染病毒與各種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，可促進趨化因子、細胞因子等炎性介質(zhì)、TAMs等炎性細胞集聚至腫瘤微環(huán)境內(nèi)，參與腫瘤的惡變程度[12]。感染病毒引發(fā)的慢性炎性反應(yīng)會導(dǎo)致巨噬細胞CD163的功能活化。其表達水平隨著宮頸癌的惡性程度的進展而逐漸升高[13]。腫瘤微環(huán)境經(jīng)由血管內(nèi)皮生長因子C促進生成脈管，同時增強腫瘤細胞的侵襲、遷移、細胞增殖功能，同時與腫瘤微環(huán)境中的相關(guān)成纖維細胞和細胞因子發(fā)生作用，對免疫系統(tǒng)清除、監(jiān)視腫瘤功能進行抑制[14]。同時局部浸潤的腫瘤微環(huán)境可出現(xiàn)各種促進腫瘤生長的細胞因子，對基質(zhì)降解酶進行釋放后引發(fā)癌細胞的轉(zhuǎn)移侵襲，局部活化的宮頸癌巨噬細胞表達血管內(nèi)皮生長因子C水平顯著增高[15]，形成癌細胞周圍癌性淋巴管，促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[16]。但腫瘤微環(huán)境能否作為評估宮頸癌預(yù)后的預(yù)測因子具有一定的爭議性[17]，TAMs的升高可引發(fā)淋巴管密度增高，引發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，患者的生存時間顯著縮短[18]。本研究因缺少隨訪數(shù)據(jù)，研究樣本量有限，不能進一步分析巨噬細胞分子標(biāo)志物CD163、CD204與宮頸癌患者的生存時間和預(yù)后進行深入分析[19-20]。

綜上所述，巨噬細胞中的CD163的表達水平與高危型人乳頭狀瘤病毒密切相關(guān)，巨噬細胞CD204、CD163、CD68的表達水平隨著宮頸癌的惡性程度而逐漸增高，高危型人乳頭狀瘤病毒引發(fā)的宮頸癌可選擇巨噬細胞CD204、CD163、CD68作為其進展發(fā)生的前瞻性預(yù)測因子。