彭寧，何松青，尚麗明，肖開銀

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，廣西 南寧5300210

膽囊癌是膽道系統(tǒng)的惡性腫瘤，病因復(fù)雜，治愈難度較大，發(fā)病率較高，發(fā)病機制復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，膽囊癌的發(fā)生發(fā)展過程涉及多個基因[1]。慢性炎癥、結(jié)石、結(jié)腸炎及膽囊息肉等均可導(dǎo)致膽囊癌。早期膽囊癌無特異性，多數(shù)患者確診時已處于晚期，治愈率較低，對化療不敏感，術(shù)后生存率較低。研究顯示，膽囊癌發(fā)病率逐年上升，其發(fā)生發(fā)展過程與神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物1（glioma-associated oncogene homolog 1，GLI1）和磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（phosphorylated-signal transduction and activator of transcription 3，p-STAT3）等分子有關(guān)[2]。GLI1屬于轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控Hedgehog信號通路下游基因的轉(zhuǎn)錄過程[3]。Hedgehog信號通路可促進胚胎發(fā)育及腫瘤的發(fā)生發(fā)展，GLI1可活化該信號通路的下游靶基因，在Hedgehog信號通路中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。本研究探討了GLI1和p-STAT3蛋白在膽囊癌中的表達(dá)情況及其與膽囊癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年6月至2017年6月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的膽囊癌和慢性膽囊炎患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①膽囊癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考人民衛(wèi)生出版社《外科學(xué)》第八版[3]；②慢性膽囊炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中國慢性膽囊炎、膽囊結(jié)石內(nèi)科診療共識意見（2018年）》[4]；③Nevin分期為Ⅰ～Ⅳ期；④手術(shù)前未接受放化療或免疫治療；⑤臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移性膽囊癌；②合并其他部位惡性腫瘤；③合并免疫系統(tǒng)疾病或風(fēng)濕性疾病。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入60例膽囊癌患者和60例慢性膽囊炎患者。膽囊癌患者中男20例，女40例；年齡38～79歲，平均年齡為（54.0±10.2）歲；腫瘤直徑：≥2 cm 37例，＜2 cm 23例；分化程度：高分化13例，中分化16例，低分化31例；Nevin分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期14例，Ⅲ期32例，Ⅳ期4例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例。慢性膽囊炎患者中男17例，女43例，年齡40～79歲，平均年齡為（55.7±11.0）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

取膽囊癌患者的膽囊癌組織標(biāo)本，以及慢性膽囊炎患者的膽囊炎組織標(biāo)本。將組織標(biāo)本烤片后脫蠟水化，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗，常溫孵育，抗原修復(fù)，5%牛血清白蛋白封閉。兔抗人GLI1單克隆抗體與兔抗人p-STAT3單克隆抗體作為一抗，封閉過夜，PBS沖洗后，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔抗體作為二抗，室溫孵育2 h，PBS沖洗30～45 min。滴加HRP標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，常溫孵育，PBS沖洗，加入二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液，顯微鏡下控制顯色，顯色滿意后用蒸餾水沖洗。蘇木素染色后鹽酸乙醇浸泡分化，自來水沖洗后氨水返藍(lán)，自來水沖洗。切片依次放入75%、90%、100%乙醇中，10 min后二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 觀察指標(biāo)和評估標(biāo)準(zhǔn)

GLI1、p-STAT3蛋白主要定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，陽性表達(dá)根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例及染色強度分別計分。按陽性細(xì)胞所占比例：≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；按染色強度：基本不著色為0分，呈淺黃色為1分，呈棕黃色為2分，呈褐色或黑色為3分；染色強度與陽性細(xì)胞所占比例評分相乘后得出綜合評分，綜合評分＜3分為陰性表達(dá)，≥3分為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GLI 1、p-STAT 3蛋白陽性表達(dá)情況的比較

膽囊癌組織中GLI1、p-STAT3蛋白的陽性表達(dá)率均明顯高于膽囊炎組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 膽囊癌和膽囊炎組織中GLI 1、p-STAT 3蛋白陽性表達(dá)情況的比較[ n（%）]

2.2 不同臨床特征膽囊癌患者膽囊癌組織中GLI 1、p-STAT 3蛋白表達(dá)情況的比較

不同性別、腫瘤直徑膽囊癌患者膽囊癌組織中GLI1、p-STAT3蛋白陽性表達(dá)率的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。不同分化程度、Nevin分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況膽囊癌患者膽囊癌組織中GLI1蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.640、5.000、10.506，P＜0.05）；不同分化程度、Nevin分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況膽囊癌患者膽囊癌組織中p-STAT3蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.993、9.248、7.074，P＜0.05）。（表2）

3 討論

膽囊癌是一種病情較為復(fù)雜的膽道系統(tǒng)惡性腫瘤，包括腺癌、硬癌、乳頭癌、黏液癌及未分化癌等[4-6]。膽囊癌發(fā)病率較高，女性發(fā)病率高于男性，且病因復(fù)雜，慢性炎癥、細(xì)菌感染、膽囊結(jié)石、免疫遺傳和膽囊息肉等均被認(rèn)為與膽囊癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。膽囊癌的早期診斷較為困難，確診時多已經(jīng)出現(xiàn)區(qū)域性的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或腫瘤細(xì)胞已經(jīng)侵襲機體的其他組織，處于晚期。目前，臨床多采用計算機斷層掃描（CT）作為膽囊癌的主要診斷方式，但對早期膽囊癌的診斷效能較低。為提高早期膽囊癌的診斷特異度，提高根治率，改善預(yù)后，需要對與膽囊癌有關(guān)的生物分子進行研究。

Hedgehog信號通路在膽囊癌發(fā)生發(fā)展及胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。該信號通路主要由配體聲波刺猬信號分子（sonic hedgehog signaling molecule，SHH）、跨膜蛋白Patched（PTCH）、跨膜蛋白Smoothened（SMO）、核轉(zhuǎn)錄因子GLI1構(gòu)成[7-10]。若PTCH未與SHH結(jié)合，PTCH即可抑制SMO的活化，進而抑制Hedgehog信號通路的激活；若PTCH與SHH結(jié)合，PTCH對SMO的抑制作用消失，促進SMO的釋放，激活PTCH下游轉(zhuǎn)錄因子GLI1，促進GLI1向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而激活Hedgehog信號通路[11]。Hedgehog信號通路的過度活化可導(dǎo)致腫瘤惡化，促進腫瘤細(xì)胞增殖并增強其耐藥性。研究表明，GLI1在Hedgehog信號通路中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，GLI1在膽囊癌細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常的膽囊細(xì)胞中不表達(dá)[12]。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，與細(xì)胞的生理生化、免疫調(diào)節(jié)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。正常情況下，機體內(nèi)的STAT3激活快速且短暫，信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑較復(fù)雜。STAT3主要受機體內(nèi)外因素的影響而持續(xù)激活，可出現(xiàn)非正常、非生理性的基因調(diào)控紊亂，對機體造成重大創(chuàng)傷，甚至誘發(fā)腫瘤。機體含有多種的細(xì)胞因子和生長因子，其酪氨酸基因位點磷酸化后被激活，受體介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子STAT3也發(fā)生磷酸化，即p-STAT3，并在細(xì)胞膜SH2的作用下，形成同源二聚體或異源二聚體。細(xì)胞質(zhì)中的二聚體可進入細(xì)胞核，特異性的DNA片段被識別并結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)惡性腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)[13]。研究顯示，腫瘤細(xì)胞中的STAT3被激活后，可呈持續(xù)激活狀態(tài)；而正常機體的生理環(huán)境中的STAT3被激活后，其激活狀態(tài)僅能維持極其短暫的時間[14-15]。

本研究中，膽囊癌組織中GLI1、p-STAT3蛋白的陽性表達(dá)率均明顯高于膽囊炎組織，表明STAT3是膽囊癌重要參與因子，為臨床防治膽囊癌提供了可能性。GLI1、p-STAT3表達(dá)水平較高可能提示膽囊癌的高侵襲性及強轉(zhuǎn)移能力。低分化、Nevin分期為Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膽囊癌患者膽囊癌組織中GLI1、p-STAT3蛋白的陽性表達(dá)率均高于中高分化、Nevin分期為Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膽囊癌患者，表明GLI1、p-STAT3可能與膽囊癌的分化程度有關(guān)。

綜上所述，GLI1、p-STAT3蛋白在膽囊癌組織中陽性表達(dá)率較高，且可能與膽囊癌的分化程度、Nevin分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。