黃世超，王丙武，陳向陽(yáng)

1徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，江蘇 徐州221000

2徐州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇 徐州2210000

骨肉瘤是一種常見(jiàn)的骨原發(fā)惡性腫瘤，有侵襲力強(qiáng)、轉(zhuǎn)移率高等特點(diǎn)，治療難度較大[1]?；熓悄壳爸委熢摬〉某Ｒ?jiàn)方法，該方法雖然大大提高了患者的生活質(zhì)量，但仍有約一半的患者因化療后轉(zhuǎn)移死亡[2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種促血管生成因子，是影響惡性腫瘤新生血管形成的重要因素之一?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是一類內(nèi)肽酶，在腫瘤的發(fā)展以及血管的生成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[3-4]。VEGF和MMP[主要是基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）]是抗血管生成治療的兩個(gè)重要靶因子，廣泛參與腫瘤的惡性侵襲和轉(zhuǎn)移。VEGF和MMP多集中表達(dá)于上皮源性腫瘤，有關(guān)VEGF和MMP與骨肉瘤關(guān)系的報(bào)道較少。為此，本研究探討VEGF和MMP在骨肉瘤中的表達(dá)及臨床意義，以指導(dǎo)骨肉瘤抗血管生成治療，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年5月至2017年7月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院接診的骨肉瘤患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合世界衛(wèi)生組織（WHO）關(guān)于骨肉瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，且經(jīng)病理學(xué)檢查確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他器官惡性腫瘤者。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)共納入80例骨肉瘤患者，其中男43例，女37例；年齡18～50歲，平均（23.9±8.2）歲；腫瘤部位：四肢54例，軀干26例；腫瘤大小：≤4 cm 47例，＞4 cm 33例；Enneking分期[6]：Ⅱ期44例，Ⅲ期36例；有軟組織浸潤(rùn)52例，無(wú)軟組織浸潤(rùn)28例。所有患者均取手術(shù)切除骨肉瘤標(biāo)本。選取同期在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院治療的50例非瘤性骨折患者作為對(duì)照，用活檢夾取黏膜下層組織，其中男28例，女22例；年齡16～51歲，平均（22.3±7.7）歲。骨肉瘤與非瘤性骨折患者的性別和年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 檢測(cè)方法

二氨基聯(lián)苯胺顯色劑購(gòu)自上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司。所有的待檢測(cè)組織標(biāo)本均經(jīng)中性福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。根據(jù)免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（streptavidin-perosidase，SP）試劑盒（購(gòu)自上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司）說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)骨肉瘤和非瘤性骨組織中VEGF、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)情況，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知的VEGF、MMP2、MMP9陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

結(jié)果判定：以細(xì)胞膜黃染和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野，避開(kāi)出血、壞死和腫瘤細(xì)胞變性區(qū)域。MMP2和MMP9僅作定性分析，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比＞5%為陽(yáng)性；VEGF作半定量分析，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比＜10%為陰性（-），≥10%且＜50%為弱陽(yáng)性（+），≥50%且＜80%為中等陽(yáng)性（++），≥80%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），除陰性（-）外，均為陽(yáng)性。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較骨肉瘤組織與非瘤性骨組織中VEGF、MMP2和MMP9的陽(yáng)性表達(dá)率；②分析骨肉瘤組織中VEGF、MMP2和MMP9的表達(dá)情況與腫瘤大小、腫瘤部位、Enneking分期和有無(wú)軟組織浸潤(rùn)的關(guān)系；③分析骨肉瘤組織中MMP2、MMP9與VEGF表達(dá)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF、MMP 2和MMP 9陽(yáng)性表達(dá)情況的比較

骨肉瘤組織中VEGF、MMP2和MMP9的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于非瘤性骨組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 骨肉瘤組織與非瘤性骨組織中VEGF、MMP 2和MMP 9陽(yáng)性表達(dá)情況的比較[ n（%）]

2.2 VEGF、MMP 2和MMP 9的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

不同腫瘤大小、腫瘤部位的骨肉瘤患者的骨肉瘤組織中VEGF、MMP2和MMP9陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Enneking分期為Ⅲ期、有軟組織浸潤(rùn)的骨肉瘤患者的骨肉瘤組織中VEGF、MMP2和MMP9陽(yáng)性表達(dá)率均高于Enneking分期為Ⅱ期、無(wú)軟組織浸潤(rùn)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征骨肉瘤患者的骨肉瘤組織中VEGF、MMP 2和MMP 9的陽(yáng)性表達(dá)情況（ n=80）

2.3 MMP 2、MMP 9與VEGF表達(dá)的相關(guān)性

骨肉瘤組織中MMP2、MMP9與VEGF表達(dá)均呈顯著正相關(guān)（r=0.657、0.510，P＜0.01）。

3 討論

骨肉瘤是一種好發(fā)于青少年的惡性骨腫瘤，會(huì)導(dǎo)致患者骨骼畸形，進(jìn)而造成肢體殘疾，嚴(yán)重者會(huì)危及生命。骨肉瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移的過(guò)程受到諸多因素的影響，多種基因和蛋白參與其中[7]。近年來(lái)，影像學(xué)和病理學(xué)技術(shù)取得了較快的發(fā)展，骨肉瘤的診斷和治療方法也有了顯著的進(jìn)展和突破。目前，骨肉瘤的診斷一般通過(guò)病理學(xué)檢查，治療方法通常是手術(shù)切除輔以化療和靶向治療等，但其確診的難度和復(fù)發(fā)問(wèn)題仍未完全解決。骨肉瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過(guò)程與腫瘤新生血管的形成和細(xì)胞外基質(zhì)的降解密切相關(guān)[8-9]。

VEGF是一種促血管生成因子，在多種實(shí)體瘤的進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在各種多肽類血管生長(zhǎng)因子中，VEGF針對(duì)血管內(nèi)皮的特異度最高[10]。VEGF能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管的新生，增強(qiáng)其通透性。實(shí)體瘤的血管新生與腫瘤細(xì)胞分泌的多種血管生長(zhǎng)因子有關(guān)[11-12]。MMP是一類蛋白水解酶，能夠降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)，在骨肉瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)起關(guān)鍵作用。健康人的MMP表達(dá)水平通常較低，而惡性腫瘤患者的MMP表達(dá)水平明顯高于健康人。MMP2通常存在于多種惡性腫瘤中，以酶原的形式分泌至細(xì)胞外基質(zhì)中，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血管或淋巴管[13-14]。MMP2還可誘導(dǎo)血管生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[15]。MMP9可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境和血管生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移以及血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，生成新的血管[16]。

本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤組織中VEGF、MMP2和MMP9的陽(yáng)性表達(dá)率分別為62.5%、70.0%和65.0%，均明顯高于非瘤性骨組織的10.0%、14.0%和14.0%，表明三者在骨肉瘤組織中高表達(dá)，在骨肉瘤的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，此結(jié)果也符合上述結(jié)論。本研究分析了骨肉瘤組織中VEGF、MMP2和MMP9的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，不同腫瘤大小、腫瘤部位的骨肉瘤患者的骨肉瘤組織中VEGF、MMP2和MMP9陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Enneking分期為Ⅲ期、有軟組織浸潤(rùn)的骨肉瘤患者的骨肉瘤組織中VEGF、MMP2和MMP9陽(yáng)性表達(dá)率均高于Enneking分期為Ⅱ期、無(wú)軟組織浸潤(rùn)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明VEGF、MMP2和MMP9的表達(dá)與軟組織浸潤(rùn)和Enneking分期有關(guān)。有研究報(bào)道，細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解為腫瘤周?chē)?rùn)的生物學(xué)基礎(chǔ)，MMP在細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解中承擔(dān)著重要作用[17]，因而MMP廣泛參與腫瘤組織的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，這與本研究結(jié)果吻合。軟組織浸潤(rùn)和Enneking分期均與骨肉瘤的預(yù)后有關(guān)，因此，可以認(rèn)為VEGF、MMP2和MMP9的高表達(dá)會(huì)給患者帶來(lái)較差的預(yù)后。本研究分析了骨肉瘤組織中VEGF與MMP2、MMP9表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示MMP2、MMP9與VEGF的表達(dá)均呈顯著正相關(guān)。提示VEGF與MMP2、MMP9在骨肉瘤的侵襲生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中有正向調(diào)節(jié)作用，協(xié)同參與骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展，而且三者的表達(dá)情況可以作為判斷腫瘤侵襲能力的標(biāo)志。有研究認(rèn)為在此過(guò)程中MMP9作為重要調(diào)節(jié)因子，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中處于VEGF上游位置[18]。綜上所述，VEGF、MMP2和MMP9在骨肉瘤組織中高表達(dá)，且其表達(dá)均與患者的軟組織浸潤(rùn)和Enneking分期有關(guān)，三者協(xié)同參與了骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展。