曾東，馮艷玲，鄭葉，楊月香，石雨涵

上海市（復(fù)旦大學(xué)附屬）公共衛(wèi)生臨床中心病理科，上海2015080

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種高病死率的疾病，是較為常見的肝臟惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅患者的生命安全[1]。但HCC在發(fā)病早期不易確診，且多被患者忽視，因此有效的早期篩查是降低HCC致死風(fēng)險(xiǎn)的主要手段[2]。隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步，血液相關(guān)因子診斷受到重視。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是診斷原發(fā)性HCC的特異性腫瘤標(biāo)志物，但部分肝硬化患者的AFP表達(dá)水平也會(huì)出現(xiàn)異常增高，同時(shí)20%的晚期肝癌患者直至病死前，AFP的表達(dá)仍處于較低水平[3]。β-聯(lián)蛋白（β-catenin）、zeste 2多梳抑制復(fù)合物2亞基增強(qiáng)子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）均為肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要調(diào)節(jié)因子，在肝癌的診療中扮演重要角色，因此為了選擇能夠輔助AFP確診HCC的血液相關(guān)因子，本研究采用β-catenin與EZH2聯(lián)合診斷后再聯(lián)合AFP的診斷方案，取得了較佳的診斷效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年1月至2019年1月于上海市（復(fù)旦大學(xué)附屬）公共衛(wèi)生臨床中心接受檢查的疑似HCC的患者92例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均具有肝炎病史，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，無其他合并癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴嚴(yán)重黃疸、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；凝血功能障礙；伴嚴(yán)重感染。92例患者中，經(jīng)穿刺病理檢查確診HCC 50例，肝硬化23例，肝血管瘤19例。50例HCC患者中，男性31例，女性19例；年齡46～68歲，平均（54.5±5.3）歲；TNM分期[4]：Ⅰ期18例，Ⅱ期32例。42例非HCC患者中，男性25例，女性17例；年齡44～69歲，平均（53.8±6.0）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究通過上海市（復(fù)旦大學(xué)附屬）公共衛(wèi)生臨床中心倫理委員會(huì)審查，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法

所有HCC患者于入院時(shí)采集清晨空腹靜脈血2 ml并儲(chǔ)存至-80℃冰箱，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（購自美國Sigma公司）檢測(cè)β-catenin和EZH2的濃度，采用美國貝克曼庫爾特全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)AFP的表達(dá)情況，AFP＞25ng/ml定義為陽性。50例HCC患者均于術(shù)后取腫瘤組織和相應(yīng)癌旁組織（距腫瘤邊緣1 cm），23例肝硬化患者采用手術(shù)穿刺方法取肝硬化組織，19例肝血管瘤患者采用穿刺方法取正常肝組織。所有組織石蠟包埋后，采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定β-catenin、EZH2和STAT3的陽性表達(dá)情況[5]。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

每例標(biāo)本隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野（×400），分別計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，判斷β-catenin、EZH2和STAT3蛋白在各組織中的陽性表達(dá)情況。陽性表達(dá)指數(shù)為陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分及細(xì)胞質(zhì)染色強(qiáng)度評(píng)分相加。陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：無陽性細(xì)胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。細(xì)胞質(zhì)染色強(qiáng)度評(píng)分：無色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分。陽性表達(dá)指數(shù)＞3分為陽性，≤3分為陰性。

1.4 觀察指標(biāo)

以穿刺病理檢查結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，分析各指標(biāo)診斷HCC的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和Kappa值。靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性+假陰性）例數(shù)×100%，特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陽性）例數(shù)×100%，準(zhǔn)確度=（真陰性+真陽性）例數(shù)/（真陽性+真陰性+假陽性+假陰性）例數(shù)×100%，陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/（真陽性+假陽性）例數(shù)×100%，陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陰性）例數(shù)×100%。本研究采用βcatenin和EZH2聯(lián)合診斷，兩種診斷指標(biāo)均為陽性則判為陽性，否則為陰性；β-catenin和EZH2聯(lián)合診斷后的結(jié)果再與AFP聯(lián)合診斷，前者結(jié)果與AFP中有一個(gè)為陽性即可判為陽性，否則為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-catenin、EZH 2、AFP對(duì)HCC的診斷價(jià)值

β-catenin單獨(dú)診斷HCC的準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、Kappa值分別為67.4%、78.0%、54.8%、67.2%、67.6%、0.33，EZH2單獨(dú)診斷HCC的上述指標(biāo)分別為66.3%、70.0%、61.9%、68.6%、63.4%、0.32；二者與AFP聯(lián)合診斷HCC的上述指標(biāo)分別為89.1%、90.0%、88.1%、90.0%、88.1%、0.78。（表1）

表1 β-catenin、EZH 2單獨(dú)及聯(lián)合AFP診斷HCC與病理診斷結(jié)果的對(duì)照

2.2 不同組織中 β-catenin及EZH 2陽性表達(dá)情況的比較

HCC組織中β-catenin和EZH2陽性表達(dá)率均高于正常組織、肝硬化組織和癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；肝硬化組織中β-catenin和EZH2陽性表達(dá)率均高于正常組織和癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同組織中 β-catenin及EZH 2陽性表達(dá)情況的比較[ n（%）]

2.3 血漿與HCC組織中 β-catenin及EZH 2表達(dá)的相關(guān)性

HCC組織中β-catenin陽性表達(dá)及陰性表達(dá)患者的血漿β-catenin表達(dá)水平分別為（315.0±27.8）、（96.2±11.2）ng/L，HCC組織中EZH2陽性表達(dá)及陰性表達(dá)患者的血漿EZH2表達(dá)水平分別為（632.5±99.5）、（169.3±22.9）ng/L。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析可知，血漿中β-catenin及EZH2的表達(dá)情況與HCC組織中陽性表達(dá)情況均呈正相關(guān)（r=0.638、0.920，P＜0.05）。2.4 HCC組織中STAT 3與 β-catenin及EZH 2表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析可知，HCC組織中STAT3的表達(dá)與β-catenin及EZH2的表達(dá)均呈正相關(guān)（r=0.652、0.423，P＜0.05）。（表3）

表3 HCC組織中STAT 3、 β-catenin及EZH 2的表達(dá)情況

3 討論

β-catenin在人類的胚胎發(fā)育和腫瘤形成中具有重要的作用[6]。當(dāng)細(xì)胞接受外界條件刺激時(shí)，β-連環(huán)蛋白 1（catenin beta 1，CTNNB1）基因表達(dá)上調(diào)，使下游因子β-catenin表達(dá)升高，隨后β-catenin被絲氨酸磷酸化激活，提高腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力[7]。而EZH2是多梳抑制復(fù)合體2（polycomb repressive complex 2，PRC2）的甲基化酶亞基，其過表達(dá)和突變均可以誘發(fā)、促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[8]。而上述兩種因子雖然在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，但二者是否能夠作為早期篩查指標(biāo)，且組織和血漿中的表達(dá)關(guān)聯(lián)性研究鮮有報(bào)道。AFP是診斷HCC的常用指標(biāo)，但仍有20%的HCC患者出現(xiàn)漏診[9]。因此，本研究將β-catenin與EZH2先聯(lián)合診斷后再與AFP聯(lián)合進(jìn)行HCC的診斷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方案診斷靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度均在80%以上，且Kappa值＞0.6，與二者單獨(dú)診斷相比，診斷價(jià)值高。HCC組織中β-catenin與EZH2的陽性表達(dá)率均高于癌旁組織、肝硬化組織和正常肝組織，提示β-catenin和EZH2在原發(fā)性HCC組織中的陽性表達(dá)率較高，聯(lián)合診斷HCC具有一定輔助指導(dǎo)意義。但通常情況下，臨床實(shí)踐中會(huì)選擇更方便的診斷方式，而組織取材過于繁瑣且會(huì)對(duì)患者造成創(chuàng)傷，可接受度不高[10]。血液檢查是常用的檢查方式，因此本研究觀察了HCC患者組織和血液中β-catenin和EZH2表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)二者在血漿和組織中的表達(dá)均呈正相關(guān)，且相關(guān)性較強(qiáng)，提示血液中β-catenin和EZH2的表達(dá)也可以作為HCC的輔助診斷手段。

STAT3是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子家族的重要成員，在多種腫瘤細(xì)胞中被激活且過表達(dá)[11]。本研究中STAT3與β-catenin和EZH2表達(dá)均呈正相關(guān)。提示β-catenin和EZH2在HCC中高表達(dá)可能與STAT3有關(guān)。有研究顯示，STAT3可能旁作用于WNT經(jīng)典信號(hào)通路從而激活β-catenin的表達(dá)[12]。相似地EZH2能夠通過加強(qiáng)STAT3的磷酸化使其過表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[13]。還有研究顯示，EZH2能夠通過激活STAT3從而增強(qiáng)腎細(xì)胞癌的侵襲能力[14]。

綜上所述，β-catenin和EZH2在原發(fā)性HCC組織中表達(dá)水平較高，可以作為原發(fā)性HCC的輔助診斷手段，能夠提高AFP診斷的準(zhǔn)確度，且STAT3可能參與了β-catenin和EZH2的高表達(dá)過程。