陳思宇,張強(qiáng),李妍
1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬長(zhǎng)壽人民醫(yī)院消化內(nèi)科,重慶401220
2陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科,重慶4000000
結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,全球每年有超過(guò)120萬(wàn)的新發(fā)病例,中國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率逐年上升,且呈年輕化的趨勢(shì),即使接受根治術(shù)治療,仍有20%~40%的患者出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移,成為治療的難點(diǎn)及主要的致死因素[1-3]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移時(shí),細(xì)胞表型會(huì)發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithe-lial-mesenchymal transition,EMT),減弱了腫瘤細(xì)胞的極性及細(xì)胞間緊密連接,且可同時(shí)表達(dá)多種侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃離原發(fā)灶,向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4-5]。
研究表明,多種蛋白均可參與腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程,其中間隙連接蛋白家族能夠維持細(xì)胞的上皮表型,抑制腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程[6]。由間隙連接蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的新陳代謝,傳遞增殖和分化信號(hào),可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的多種生理過(guò)程。間隙連接蛋白32(connexin 32,CX32)作為間隙連接蛋白家族的重要成員之一,在結(jié)腸癌細(xì)胞中異常表達(dá),與結(jié)腸癌臨床分期以及腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)[7]。CXC趨化因子受體 4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)表達(dá)于細(xì)胞膜,可被基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1,SDF1)激活,從而將細(xì)胞外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi);CXCR4還可通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的G蛋白偶聯(lián)受體引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng),激活CXCR4的增殖和轉(zhuǎn)移信號(hào)。Src是CXCR4信號(hào)通路的核心效應(yīng)分子,而磷酸化Src(phospho-Src,p-Src)的激活可直接調(diào)控CXCR4信號(hào)通路。本研究探討CX32對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及可能的作用機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。
選取2015年3月至2017年12月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬長(zhǎng)壽人民醫(yī)院收治的結(jié)腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn):①均接受結(jié)腸癌根治術(shù)治療,并取得結(jié)腸癌組織標(biāo)本;②術(shù)后病理確診為結(jié)腸癌;③臨床及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前均未接受放化療。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn),本研究共納入47例結(jié)腸癌患者,其中男23例,女24例;年齡38~73歲;Dukes分期:A~B期16例,C~D期31例;TNM分期:Ⅰ~Ⅱ期11例,Ⅲ~Ⅳ期36例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例;遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移39例,無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移8例。
人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)細(xì)胞庫(kù),CX32過(guò)表達(dá)載體購(gòu)自美國(guó)Addgene公司,兔抗人CX32、兔抗人CXCR4、兔抗人Src、兔抗人p-Src和兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。
1.3.1 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)CX32和CXCR 4蛋白的表達(dá)情況 取結(jié)腸癌組織石蠟標(biāo)本連續(xù)切片脫蠟水化,3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,微波修復(fù),室溫下血清封閉。加入一抗(稀釋濃度為1∶100),磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照,4℃冰箱過(guò)夜,次日常溫下孵育二抗,二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹(shù)膠封片。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×100),采用Mattern積分法評(píng)估CX32蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況:①細(xì)胞陽(yáng)性率評(píng)分,陽(yáng)性細(xì)胞所占比例<10%為0分,10%~24%為1分,25%~49%為2分,50%~100%為3分;②免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度評(píng)分,無(wú)著色為0分,淡黃色為1分,深黃色為2分,棕褐色為3分;將細(xì)胞陽(yáng)性率評(píng)分和免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度評(píng)分相加得最終總分,總分≤3分為陰性表達(dá),總分>3分則為陽(yáng)性表達(dá)。采用IPP軟件對(duì)免疫組織化學(xué)染色樣本中陽(yáng)性染色區(qū)域進(jìn)行定量計(jì)算,并進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。
1.3.2 生物信息學(xué)分析 結(jié)腸癌患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)下載自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù),根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中765例結(jié)腸癌患者CX32mRNA表達(dá)數(shù)據(jù),將本研究中的47例結(jié)腸癌患者按照數(shù)據(jù)庫(kù)中界定的相對(duì)表達(dá)量(11071)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。同時(shí)通過(guò)基因集合富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)網(wǎng)站(http://software.broadinstitute.org)下載與結(jié)腸癌侵襲相關(guān)的基因子集,該基因集中基因均為侵襲性結(jié)腸癌組織中呈上調(diào)表達(dá)的基因。采用GSEA 3.0軟件對(duì)結(jié)腸癌組織中CX32的表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲相關(guān)基因的關(guān)系進(jìn)行基因富集分析。1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法 采用含90%DMEM和1%雙抗(100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)及10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞系,置于37℃、5%CO2恒溫恒濕的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度約為80%時(shí),胰蛋白酶消化傳代。將CX32過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞系,作為研究組,未作處理的細(xì)胞作為對(duì)照組,繼續(xù)培養(yǎng)24~48 h,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法(Westernblot)檢測(cè)CX32、CXCR 4、Src、p-Src蛋白的相對(duì)表達(dá)量 取研究組和對(duì)照組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞,裂解液裂解,提取細(xì)胞總蛋白,采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)80 V恒壓電泳2 h,250 mA恒流1.5 h將目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入一抗(稀釋濃度為1∶1000),4℃孵育過(guò)夜;次日室溫孵育1 h,洗膜3次,加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h,洗膜3次后顯影。采用Image J軟件測(cè)量每個(gè)條帶的灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值表示CX32、CXCR4、Src、p-Src蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
1.3.5 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 取研究組和對(duì)照組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞,胰蛋白酶消化后,無(wú)血清培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml,取200 μl細(xì)胞懸液加入鋪好Matrigel膠的Transwell上室中,下室加入600 μl含20%血清的培養(yǎng)基,37℃孵育24 h,棉簽擦去上室的非遷移細(xì)胞,移出Transwell小室,倒置風(fēng)干,甲醛固定30 min,采用0.1%結(jié)晶紫染色15 min,PBS沖洗,倒置風(fēng)干觀察。細(xì)胞侵襲能力采用IPP軟件進(jìn)行評(píng)估,該軟件可對(duì)圖片的染色區(qū)域進(jìn)行分析,計(jì)算積分光密度(integral optical density,IOD)。
采用SPSS 21.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析;以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
Mattern積分法結(jié)果顯示,CX32陰性表達(dá)34例,CX32陽(yáng)性表達(dá)13例。不同性別、Dukes分期結(jié)腸癌患者CX32陽(yáng)性表達(dá)率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況結(jié)腸癌患者CX32陽(yáng)性表達(dá)率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(表1)
表1 不同臨床特征結(jié)腸癌患者CX32陽(yáng)性表達(dá)情況的比較( n=47)
相關(guān)性分析結(jié)果顯示,CX32陽(yáng)性表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均呈明顯正相關(guān)(r=0.540、0.680、0.490,P<0.01);CX32陽(yáng)性表達(dá)與性別和Dukes分期無(wú)相關(guān)性(r=0.023、0.017,P>0.05)。
基因富集分析發(fā)現(xiàn),與結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲相關(guān)的基因子集多數(shù)富集在CX32低表達(dá)的藍(lán)色區(qū)域,CX32的表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲呈負(fù)相關(guān),標(biāo)準(zhǔn)化富集得分(normalizedenrichmentscore,NES)=-1.034,標(biāo)準(zhǔn)化P值=0.04。(圖1)
圖1 CX32與結(jié)腸癌侵襲相關(guān)的基因富集分析
根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)CX32mRNA的相對(duì)表達(dá)水平界值,將本研究47例結(jié)腸癌患者分為高表達(dá)組(n=23)和低表達(dá)組(n=24例),高表達(dá)組患者CX32mRNA的相對(duì)表達(dá)量為(13025±103),明顯高于低表達(dá)組患者的(9782±97),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.571,P<0.01)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,低表達(dá)組患者中,腫瘤組織的形態(tài)更加紊亂,腫瘤細(xì)胞雜亂聚集,惡性程度更高,CXCR4的分布更加廣泛;而在高表達(dá)組患者中,腫瘤組織的形態(tài)更加規(guī)則,腫瘤細(xì)胞的分布更加均勻,且CXCR4的表達(dá)也較局限(圖2)。低表達(dá)組結(jié)腸癌患者CXCR4的相對(duì)表達(dá)量為(8874.56±156.12),明顯高于高表達(dá)組患者的(1256.34±105.48),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.785,P<0.01)。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,CX32的表達(dá)與CXCR4呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.720,P<0.01)。
圖2 低表達(dá)組和高表達(dá)組結(jié)腸癌患者CXCR 4蛋白的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色,×100)
研究組LoVo細(xì)胞CX32蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);且研究組LoVo細(xì)胞CXCR4和p-Src蛋白的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組細(xì)胞,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(表2)
表2 對(duì)照組和研究組細(xì)胞CX32、CXCR 4、Src、p-Src蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較( ± s)
表2 對(duì)照組和研究組細(xì)胞CX32、CXCR 4、Src、p-Src蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較( ± s)
組別對(duì)照組研究組t值P值CX32 0.01±0.00 0.15±0.01 19.256 0.003 CXCR4 3.05±0.01 0.98±0.01 9.896 0.002 Src 1.89±0.02 1.78±0.02 1.297 0.086 p-Src 2.05±0.01 1.23±0.02 15.687 0.015
Transwell小室檢測(cè)結(jié)果顯示,研究組細(xì)胞陽(yáng)性著色的平均IOD值為(688.51±69.32),低于對(duì)照組的(2024.38±99.81),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.516,P<0.05)。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,CX32表達(dá)與細(xì)胞侵襲能力呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.750,P<0.01)。
結(jié)腸癌是中國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,發(fā)病率逐年上升,嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康[8]。間隙連接蛋白廣泛參與機(jī)體的生理和病理活動(dòng),可通過(guò)形成細(xì)胞間隙連接通訊,進(jìn)行細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),為物質(zhì)代謝提供通道,在乳腺癌、胃癌、皮膚癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[9]。研究表明,CX32表達(dá)下調(diào)與結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。本研究結(jié)果顯示,CX32的表達(dá)與結(jié)腸癌患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均呈明顯正相關(guān)。為探討CX32的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響,本研究將CX32表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至LoVo細(xì)胞,結(jié)果顯示,研究組細(xì)胞陽(yáng)性著色的平均IOD低于對(duì)照組,發(fā)現(xiàn)原本侵襲能力較強(qiáng)的LoVo細(xì)胞在過(guò)表達(dá)CX32后侵襲能力明顯減弱,表明CX32可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力。
結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是其惡性表型的重要體現(xiàn),也是導(dǎo)致結(jié)腸癌難治及易復(fù)發(fā)的重要因素。結(jié)腸癌細(xì)胞接受趨化信號(hào)刺激后,細(xì)胞內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)信號(hào)通路被激活,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞脫離了原發(fā)病灶,向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。CXCR4是腫瘤細(xì)胞最重要的趨化因子受體之一,在骨腫瘤、腦腫瘤、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)水平均較高,在結(jié)腸癌中也存在選擇性表達(dá)的情況,CXCR4表達(dá)上調(diào)與結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10-11]。本研究通過(guò)基因富集分析發(fā)現(xiàn),CXCR4等結(jié)腸癌侵襲相關(guān)基因在CX32低表達(dá)患者中明顯富集,此外CX32的表達(dá)與CXCR4呈明顯負(fù)相關(guān),表明CX32可能通過(guò)抑制CXCR4的信號(hào)通路來(lái)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Src是CXCR4下游的重要蛋白激酶,也是人類(lèi)最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤蛋白之一,Src在受到CXCR4的刺激后,可將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)生構(gòu)象改變,促進(jìn)包括Src在內(nèi)的多種蛋白激酶發(fā)生磷酸化,引起侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[12-13]。本研究通過(guò) Western blot法檢測(cè) CX32、CXCR4、Src、p-Src蛋白的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果顯示,研究組細(xì)胞p-Src的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組細(xì)胞,表明上調(diào)CX32的表達(dá)可明顯抑制CXCR4通路的活化。
綜上所述,CX32的表達(dá)與結(jié)腸癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均呈明顯正相關(guān),上調(diào)CX32的表達(dá)可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力。表明上調(diào)CX32的表達(dá)可能有助于提高結(jié)腸癌患者的治愈率,為結(jié)腸癌的診斷和治療提供新思路。此外,上調(diào)CX32的表達(dá)可能通過(guò)抑制CXCR4的表達(dá),抑制其下游信號(hào)通路的活化,從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,但具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。