陳思宇，張強(qiáng)，李妍

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬長(zhǎng)壽人民醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶401220

2陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶4000000

結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，全球每年有超過120萬的新發(fā)病例，中國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率逐年上升，且呈年輕化的趨勢(shì)，即使接受根治術(shù)治療，仍有20%～40%的患者出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，成為治療的難點(diǎn)及主要的致死因素[1-3]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移時(shí)，細(xì)胞表型會(huì)發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithe-lial-mesenchymal transition，EMT），減弱了腫瘤細(xì)胞的極性及細(xì)胞間緊密連接，且可同時(shí)表達(dá)多種侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃離原發(fā)灶，向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4-5]。

研究表明，多種蛋白均可參與腫瘤細(xì)胞的EMT過程，其中間隙連接蛋白家族能夠維持細(xì)胞的上皮表型，抑制腫瘤細(xì)胞的EMT過程[6]。由間隙連接蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的新陳代謝，傳遞增殖和分化信號(hào)，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的多種生理過程。間隙連接蛋白32（connexin 32，CX32）作為間隙連接蛋白家族的重要成員之一，在結(jié)腸癌細(xì)胞中異常表達(dá)，與結(jié)腸癌臨床分期以及腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)[7]。CXC趨化因子受體 4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）表達(dá)于細(xì)胞膜，可被基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF1）激活，從而將細(xì)胞外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)；CXCR4還可通過激活細(xì)胞內(nèi)的G蛋白偶聯(lián)受體引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活CXCR4的增殖和轉(zhuǎn)移信號(hào)。Src是CXCR4信號(hào)通路的核心效應(yīng)分子，而磷酸化Src（phospho-Src，p-Src）的激活可直接調(diào)控CXCR4信號(hào)通路。本研究探討CX32對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月至2017年12月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬長(zhǎng)壽人民醫(yī)院收治的結(jié)腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均接受結(jié)腸癌根治術(shù)治療，并取得結(jié)腸癌組織標(biāo)本；②術(shù)后病理確診為結(jié)腸癌；③臨床及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前均未接受放化療。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入47例結(jié)腸癌患者，其中男23例，女24例；年齡38～73歲；Dukes分期：A～B期16例，C～D期31例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期36例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移39例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移8例。

1.2 細(xì)胞和主要試劑

人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）細(xì)胞庫(kù)，CX32過表達(dá)載體購(gòu)自美國(guó)Addgene公司，兔抗人CX32、兔抗人CXCR4、兔抗人Src、兔抗人p-Src和兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)CX32和CXCR 4蛋白的表達(dá)情況 取結(jié)腸癌組織石蠟標(biāo)本連續(xù)切片脫蠟水化，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)，室溫下血清封閉。加入一抗（稀釋濃度為1∶100），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照，4℃冰箱過夜，次日常溫下孵育二抗，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野（×100），采用Mattern積分法評(píng)估CX32蛋白的陽性表達(dá)情況：①細(xì)胞陽性率評(píng)分，陽性細(xì)胞所占比例＜10%為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～100%為3分；②免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度評(píng)分，無著色為0分，淡黃色為1分，深黃色為2分，棕褐色為3分；將細(xì)胞陽性率評(píng)分和免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度評(píng)分相加得最終總分，總分≤3分為陰性表達(dá)，總分>3分則為陽性表達(dá)。采用IPP軟件對(duì)免疫組織化學(xué)染色樣本中陽性染色區(qū)域進(jìn)行定量計(jì)算，并進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。

1.3.2 生物信息學(xué)分析 結(jié)腸癌患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)下載自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中765例結(jié)腸癌患者CX32mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，將本研究中的47例結(jié)腸癌患者按照數(shù)據(jù)庫(kù)中界定的相對(duì)表達(dá)量（11071）分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。同時(shí)通過基因集合富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）網(wǎng)站（http://software.broadinstitute.org）下載與結(jié)腸癌侵襲相關(guān)的基因子集，該基因集中基因均為侵襲性結(jié)腸癌組織中呈上調(diào)表達(dá)的基因。采用GSEA 3.0軟件對(duì)結(jié)腸癌組織中CX32的表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲相關(guān)基因的關(guān)系進(jìn)行基因富集分析。1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法 采用含90%DMEM和1%雙抗（100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素）及10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞系，置于37℃、5%CO2恒溫恒濕的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度約為80%時(shí)，胰蛋白酶消化傳代。將CX32過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞系，作為研究組，未作處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測(cè)CX32、CXCR 4、Src、p-Src蛋白的相對(duì)表達(dá)量 取研究組和對(duì)照組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋白，采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）80 V恒壓電泳2 h，250 mA恒流1.5 h將目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗（稀釋濃度為1∶1000），4℃孵育過夜；次日室溫孵育1 h，洗膜3次，加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，洗膜3次后顯影。采用Image J軟件測(cè)量每個(gè)條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值表示CX32、CXCR4、Src、p-Src蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 取研究組和對(duì)照組結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，取200 μl細(xì)胞懸液加入鋪好Matrigel膠的Transwell上室中，下室加入600 μl含20%血清的培養(yǎng)基，37℃孵育24 h，棉簽擦去上室的非遷移細(xì)胞，移出Transwell小室，倒置風(fēng)干，甲醛固定30 min，采用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS沖洗，倒置風(fēng)干觀察。細(xì)胞侵襲能力采用IPP軟件進(jìn)行評(píng)估，該軟件可對(duì)圖片的染色區(qū)域進(jìn)行分析，計(jì)算積分光密度（integral optical density，IOD）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征結(jié)腸癌患者CX32蛋白陽性表達(dá)情況的比較

Mattern積分法結(jié)果顯示，CX32陰性表達(dá)34例，CX32陽性表達(dá)13例。不同性別、Dukes分期結(jié)腸癌患者CX32陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況結(jié)腸癌患者CX32陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征結(jié)腸癌患者CX32陽性表達(dá)情況的比較（ n=47）

2.2 CX32表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床特征的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CX32陽性表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均呈明顯正相關(guān)（r=0.540、0.680、0.490，P＜0.01）；CX32陽性表達(dá)與性別和Dukes分期無相關(guān)性（r=0.023、0.017，P＞0.05）。

2.3 CX32與結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的關(guān)系

基因富集分析發(fā)現(xiàn)，與結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲相關(guān)的基因子集多數(shù)富集在CX32低表達(dá)的藍(lán)色區(qū)域，CX32的表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲呈負(fù)相關(guān)，標(biāo)準(zhǔn)化富集得分（normalizedenrichmentscore，NES）=-1.034，標(biāo)準(zhǔn)化P值=0.04。（圖1）

圖1 CX32與結(jié)腸癌侵襲相關(guān)的基因富集分析

2.4 CX32與CXCR 4蛋白表達(dá)的關(guān)系

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)CX32mRNA的相對(duì)表達(dá)水平界值，將本研究47例結(jié)腸癌患者分為高表達(dá)組（n=23）和低表達(dá)組（n=24例），高表達(dá)組患者CX32mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（13025±103），明顯高于低表達(dá)組患者的（9782±97），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.571，P＜0.01）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，低表達(dá)組患者中，腫瘤組織的形態(tài)更加紊亂，腫瘤細(xì)胞雜亂聚集，惡性程度更高，CXCR4的分布更加廣泛；而在高表達(dá)組患者中，腫瘤組織的形態(tài)更加規(guī)則，腫瘤細(xì)胞的分布更加均勻，且CXCR4的表達(dá)也較局限（圖2）。低表達(dá)組結(jié)腸癌患者CXCR4的相對(duì)表達(dá)量為（8874.56±156.12），明顯高于高表達(dá)組患者的（1256.34±105.48），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.785，P＜0.01）。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CX32的表達(dá)與CXCR4呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.720，P＜0.01）。

圖2 低表達(dá)組和高表達(dá)組結(jié)腸癌患者CXCR 4蛋白的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×100）

2.5 C X32、CXCR 4、Src、p-Src蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

研究組LoVo細(xì)胞CX32蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；且研究組LoVo細(xì)胞CXCR4和p-Src蛋白的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 對(duì)照組和研究組細(xì)胞CX32、CXCR 4、Src、p-Src蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（ ± s）

表2 對(duì)照組和研究組細(xì)胞CX32、CXCR 4、Src、p-Src蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（ ± s）

組別對(duì)照組研究組t值P值CX32 0.01±0.00 0.15±0.01 19.256 0.003 CXCR4 3.05±0.01 0.98±0.01 9.896 0.002 Src 1.89±0.02 1.78±0.02 1.297 0.086 p-Src 2.05±0.01 1.23±0.02 15.687 0.015

2.6 細(xì)胞侵襲能力的比較

Transwell小室檢測(cè)結(jié)果顯示，研究組細(xì)胞陽性著色的平均IOD值為（688.51±69.32），低于對(duì)照組的（2024.38±99.81），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.516，P＜0.05）。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CX32表達(dá)與細(xì)胞侵襲能力呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.750，P＜0.01）。

3 討論

結(jié)腸癌是中國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[8]。間隙連接蛋白廣泛參與機(jī)體的生理和病理活動(dòng)，可通過形成細(xì)胞間隙連接通訊，進(jìn)行細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，為物質(zhì)代謝提供通道，在乳腺癌、胃癌、皮膚癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[9]。研究表明，CX32表達(dá)下調(diào)與結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。本研究結(jié)果顯示，CX32的表達(dá)與結(jié)腸癌患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均呈明顯正相關(guān)。為探討CX32的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，本研究將CX32表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至LoVo細(xì)胞，結(jié)果顯示，研究組細(xì)胞陽性著色的平均IOD低于對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)原本侵襲能力較強(qiáng)的LoVo細(xì)胞在過表達(dá)CX32后侵襲能力明顯減弱，表明CX32可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力。

結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是其惡性表型的重要體現(xiàn)，也是導(dǎo)致結(jié)腸癌難治及易復(fù)發(fā)的重要因素。結(jié)腸癌細(xì)胞接受趨化信號(hào)刺激后，細(xì)胞內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞脫離了原發(fā)病灶，向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。CXCR4是腫瘤細(xì)胞最重要的趨化因子受體之一，在骨腫瘤、腦腫瘤、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)水平均較高，在結(jié)腸癌中也存在選擇性表達(dá)的情況，CXCR4表達(dá)上調(diào)與結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10-11]。本研究通過基因富集分析發(fā)現(xiàn)，CXCR4等結(jié)腸癌侵襲相關(guān)基因在CX32低表達(dá)患者中明顯富集，此外CX32的表達(dá)與CXCR4呈明顯負(fù)相關(guān)，表明CX32可能通過抑制CXCR4的信號(hào)通路來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Src是CXCR4下游的重要蛋白激酶，也是人類最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤蛋白之一，Src在受到CXCR4的刺激后，可將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)生構(gòu)象改變，促進(jìn)包括Src在內(nèi)的多種蛋白激酶發(fā)生磷酸化，引起侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[12-13]。本研究通過 Western blot法檢測(cè) CX32、CXCR4、Src、p-Src蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，研究組細(xì)胞p-Src的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組細(xì)胞，表明上調(diào)CX32的表達(dá)可明顯抑制CXCR4通路的活化。

綜上所述，CX32的表達(dá)與結(jié)腸癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均呈明顯正相關(guān)，上調(diào)CX32的表達(dá)可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力。表明上調(diào)CX32的表達(dá)可能有助于提高結(jié)腸癌患者的治愈率，為結(jié)腸癌的診斷和治療提供新思路。此外，上調(diào)CX32的表達(dá)可能通過抑制CXCR4的表達(dá)，抑制其下游信號(hào)通路的活化，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，但具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。