竇娜，李春曉，王婷，王勁松，王海娟，錢海利，南鵬，張競堯，李慧，門秀麗#

1華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北唐山063200

2國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，北京1000210

國家癌癥中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌是導(dǎo)致中國癌癥相關(guān)死亡的常見惡性腫瘤之一，且發(fā)病率逐年上升[1]。2015年，中國新增結(jié)直腸癌病例數(shù)和病死人數(shù)分別為33.1萬和15.9萬[2]。目前，結(jié)直腸癌采取手術(shù)治療為主、放化療為輔的綜合治療手段[3]。雖然結(jié)直腸癌的治療水平不斷提高，但是由于結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移率高達(dá)50%～60%，故患者遠(yuǎn)期預(yù)后仍不理想[4]。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子1（metastasis associated 1，MTA1）最初是在乳腺癌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的[5]，在結(jié)腸癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[6-7]。然而，MTA1促進(jìn)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚。為闡明MTA1促進(jìn)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室前期將敲除MTA1的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116及對照細(xì)胞進(jìn)行RNA測序分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）在敲除MTA1的HCT116細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)。CK19是細(xì)胞角蛋白家族中的一員，當(dāng)上皮細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生改變時(shí)，其表達(dá)水平、細(xì)胞定位或翻譯后修飾發(fā)生改變[8]。已有研究表明，CK19在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，且與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移、預(yù)后等相關(guān)[9]，但未見MTA1與CK19關(guān)系的報(bào)道。本研究旨在探討MTA1與CK19在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)的相關(guān)性及與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年8月至2016年6月在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院行結(jié)腸癌切除手術(shù)的80例結(jié)腸癌患者，所有患者均經(jīng)過病理組織學(xué)檢查確診為結(jié)腸癌，同時(shí)取結(jié)腸癌組織與癌旁組織（距結(jié)腸癌組織1～2 cm）進(jìn)行研究。

1.2 細(xì)胞及主要試劑

人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞、敲除MTA1的HCT116細(xì)胞（HCT116crMTA1）、對照細(xì)胞（HCT116crMTA1control 2）及人胚腎293細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。慢病毒空載（Lenti-GFP）、過表達(dá)MTA1慢病毒（Lenti-MTA1）、無意義的小干擾RNA（siNC）、CK19特異性的小干擾RNA（siCK19）均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，CK19過表達(dá)質(zhì)粒與CK19過表達(dá)對照質(zhì)粒均購自廣州復(fù)能基因有限公司，psPAX2、pMD2.G均購自北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司，嘌呤霉素購自生工生物工程（上海）股份有限公司，Lipofectamine 2000購自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司，Matrigel基質(zhì)膠購自北京市普京康利科技有限公司，兔抗人MTA1購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，鼠抗人β-actin、CK19抗體分別購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司、美國Santa Cruz Biotechnology公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔及羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、SP試劑盒、PV-9001試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

由經(jīng)驗(yàn)豐富的高年資病理醫(yī)師對染色結(jié)果進(jìn)行評價(jià)，每例組織標(biāo)本分別獨(dú)立評價(jià)至少5個(gè)高倍視野，且每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè)。結(jié)合染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占百分比評分進(jìn)行結(jié)果判定。染色強(qiáng)度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；染色細(xì)胞所占百分比：無染色細(xì)胞為0分，＜10%為1分，10%～50%為2分，51%～80%為3分，＞80%為4分。兩項(xiàng)評分的乘積即為MTA1或CK19蛋白表達(dá)的最終評分，評分＞4分為MTA1或CK19蛋白高表達(dá)，評分≤4分為MTA1或CK19蛋白低表達(dá)。

1.4 細(xì)胞系的構(gòu)建

接種對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，待其融合度達(dá)30%時(shí)分別加入10 μl Lenti-MTA1和Lenti-GFP，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入嘌呤霉素篩選，分別構(gòu)建MTA1過表達(dá)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞系（HCT116MTA1）和對照細(xì)胞系（HCT116control 1）。按照1.5∶1∶2的比例將包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G和目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胚腎293細(xì)胞中（兩組目的質(zhì)粒分別是CK19過表達(dá)質(zhì)粒、CK19過表達(dá)對照質(zhì)粒），48、72 h后收集病毒，-80℃保存。待HCT116crMTA1細(xì)胞融合度達(dá)30%～50%時(shí)，加入病毒，隔天換病毒，分別構(gòu)建CK19過表達(dá)細(xì)胞系（命名為HCT116crMTA1CK19組）和CK19過表達(dá)對照細(xì)胞系（命名為HCT116crMTA1control組）。

1.5 RNA干擾實(shí)驗(yàn)

對HCT116MTA1細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siCK19和siNC，構(gòu)建敲降CK19細(xì)胞系及敲降CK19對照細(xì)胞系，命名為HCT116MTA1siCK19組和HCT116MTA1-control組，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測蛋白表達(dá)情況

收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，以10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，恒壓15 V轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗 MTA1（1∶1000）、CK19（1∶1000）、β-actin（1∶5000），4℃孵育過夜，用含0.1%吐溫-20的磷酸鹽 緩 沖 液（Tween-20 phosphate buffered saline，PBST）洗膜3次，加入二抗IgG（1∶5000），常溫孵育1 h。PBST緩沖液洗膜3次，曝光、顯影。

1.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將Matrigel基質(zhì)膠均勻包被Transwell小室的上室基底膜，置于培養(yǎng)箱中1 h，之后將100 μl細(xì)胞懸液加入上層小室中，下室加入600 μl 20%血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，甲醇固定約10 min，結(jié)晶紫溶液染色10 min，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)并拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.8 共表達(dá)基因分析

對TCGA-COAD數(shù)據(jù)集中的結(jié)直腸癌組織的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行基因共表達(dá)分析，利用cBioPortal軟件分析平臺，獲取結(jié)直腸癌在TCGA數(shù)據(jù)庫中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，篩選共表達(dá)的基因，篩選條件為：Spearman相關(guān)系數(shù)絕對值＞0.3，P＜0.05，篩選MTA1和CK19共表達(dá)的基因集，求取交集后，利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析，找出顯著富集的功能聚類項(xiàng)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)分析法進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTA 1、CK19的表達(dá)及相關(guān)性分析

采用免疫組織化學(xué)法檢測80例結(jié)腸癌組織及80例癌旁組織中MTA1及CK19的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在結(jié)腸癌組織中，MTA1在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，其中MTA1低表達(dá)9例，高表達(dá)71例；CK19主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，其中CK19低表達(dá)40例，高表達(dá)40例。而在癌旁組織中，MTA1、CK19均低表達(dá)。結(jié)腸癌組織中MTA1、CK19評分均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌組織中MTA1與CK19表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.490，P＜0.01）。

表1 結(jié)腸癌組織與癌旁組織中MTA 1與CK19評分的比較（± s）

表1 結(jié)腸癌組織與癌旁組織中MTA 1與CK19評分的比較（± s）

組織類型結(jié)腸癌組織（n=80）癌旁組織（n=80）t值P值MTA1評分7.53±2.41 1.21±1.08 21.411 0.000 CK19評分4.79±2.47 0.36±0.64 15.518 0.000

2.2 HCT116MTA 1、HCT116crMTA 1細(xì) 胞 中 的CK19表達(dá)情況

在MTA1過表達(dá)的HCT116MTA1細(xì)胞中CK19表達(dá)上調(diào)，而在敲除MTA1的HCT116crMTA1細(xì)胞中CK19表達(dá)下調(diào)。（圖1）

2.3 MTA 1、CK19對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響

圖1 Westernblot法檢測四組細(xì)胞中MTA 1與CK19的表達(dá)情況

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HCT116crMTA1control組細(xì)胞穿透細(xì)胞數(shù)為（58.33±16.07），少于HCT116crMTA1CK19組的（147.00±10.82），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.604，P＜0.05）；HCT116MTA1-control組細(xì)胞穿透細(xì)胞數(shù)為（1077.67±233.98），多于HCT116MTA1siCK19組的（671.33±78.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.853，P＜0.05）。

2.4 MTA 1、CK19共表達(dá)基因分析

通過TCGA數(shù)據(jù)庫，分別篩選得到在結(jié)直腸癌中與MTA1及CK19表達(dá)相關(guān)的基因集，然后對上述兩個(gè)基因集求取交集，進(jìn)行功能聚類分析。共篩選獲得與MTA1表達(dá)相關(guān)的基因2675個(gè)，與CK19表達(dá)相關(guān)的基因3674個(gè)，其中重疊基因2315個(gè)。利用DAVID數(shù)據(jù)分析平臺對上述重疊基因集進(jìn)行基因功能聚類分析，發(fā)現(xiàn)該基因簇參與細(xì)胞黏附、mRNA剪接、細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)合成等生物學(xué)過程（圖2），其中細(xì)胞黏附過程的參與基因包括鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白β2亞基類似物1（guanine nucleotide binding protein beta polypeptide 2-like 1，GNB2L1）、皮層肌動(dòng)蛋白（cortactin，CTTN）、α胞襯蛋白 1（spectrin alpha，non-erythrocytic 1，SPTAN1）和淋巴細(xì)胞溶質(zhì)蛋白1（lymphocyte cytosolic protein 1，LCP1）等。

圖2 與MTA 1、CK19表達(dá)相關(guān)的重疊基因的GO聚類分析

3 討論

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在中國發(fā)病率逐年增高[10]。多數(shù)患者在明確診斷時(shí)已處于癌癥晚期，腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其高病死率的主要原因[11]。雖然已知結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移是多基因共同作用的結(jié)果，但對結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制還尚未清楚。開展結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究對延長結(jié)腸癌患者生存及改善預(yù)后具有重要意義。

腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子（metastasis associated，MTA）是與腫瘤轉(zhuǎn)移高度相關(guān)的基因家族，在腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。其中，在多種腫瘤組織中高表達(dá)的MTA1基因，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的MTA家族成員[12]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)MTA1與惡性腫瘤組織的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高表達(dá)MTA1的腫瘤組織浸潤率和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯增高，且更易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移[13]。MTA1主要參與組成具有核小體重塑活性的組蛋白去乙?；?，促進(jìn)組蛋白脫乙?；?，間接調(diào)控抑制腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的基因，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的作用[14]。已有研究表明，MTA1可以通過改變細(xì)胞角蛋白的組裝，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的定位，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的惡性行為，使腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。細(xì)胞角蛋白參與調(diào)節(jié)包括細(xì)胞遷移、凋亡、侵襲與感染等多個(gè)過程[15]。已有研究表明，CK19在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，且與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移、預(yù)后等相關(guān)[9]。CK19是構(gòu)成細(xì)胞骨架蛋白中間絲的主要成分之一，參與維持上皮結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[16]。CK19在上皮來源的腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)，健康人外周血中無表達(dá)，如在腫瘤患者外周血中檢測到CK19的表達(dá)，則考慮發(fā)生血行微轉(zhuǎn)移[17]。本實(shí)驗(yàn)室前期的RNA測序結(jié)果表明CK19在敲除MTA1的HCT116細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，本研究結(jié)果顯示MTA1蛋白與CK19蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)呈顯著正相關(guān)。進(jìn)而，在過表達(dá)MTA1的HCT116細(xì)胞中應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默CK19，可減弱腫瘤細(xì)胞的侵襲能力；在敲除MTA1的HCT116細(xì)胞中過表達(dá)CK19，可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力；以上結(jié)果表明，結(jié)腸癌細(xì)胞中MTA1可通過上調(diào)CK19增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，這在既往文獻(xiàn)中未見報(bào)道。此外，為了給后續(xù)研究提供線索，本研究通過數(shù)據(jù)庫分析獲得與MTA1、CK19表達(dá)均相關(guān)的基因簇，并進(jìn)行功能聚類分析，發(fā)現(xiàn)與MTA1、CK19表達(dá)均相關(guān)的基因簇參與細(xì)胞黏附、mRNA剪接、細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)合成等過程，其中MTA1參與mRNA剪接與細(xì)胞代謝等均已有相關(guān)報(bào)道，說明該數(shù)據(jù)分析具有可靠性。同時(shí)，MTA1、CK19在細(xì)胞黏附過程中的富集分?jǐn)?shù)最高，提示MTA1、CK19可能通過調(diào)控細(xì)胞黏附過程促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。具體而言，基因功能富集分析提示，在與MTA1、CK19表達(dá)相關(guān)的基因簇中，GNB2L1、CTTN、SPTAN1和LCP1等可能參與MTA1、CK19調(diào)控的細(xì)胞黏附過程。LCP1是高度保守的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，與波形蛋白四聚體形成復(fù)合物，在細(xì)胞黏附期間參與波形蛋白的組裝并構(gòu)成細(xì)胞骨架[18]。同時(shí)，LCP1的一個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白與波形蛋白相互作用，而另一個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白可與CK19相互作用[19]。MTA1、CK19有可能通過與LCP1蛋白的相互作用進(jìn)一步影響細(xì)胞黏附過程，從而影響結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移，具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，在結(jié)腸癌組織中，MTA1和CK19表達(dá)呈正相關(guān)，MTA1可通過上調(diào)CK19促進(jìn)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞侵襲。MTA1、CK19有可能作為結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，為治療結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移提供分子治療靶點(diǎn)，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。