于麗華，滕飛，蔣明，郭佳

同濟(jì)大學(xué) 蘇州研究院，江蘇 蘇州 215000

kras基因突變是結(jié)直腸癌、肺癌和胰腺癌等癌癥中最常見的突變類型之一[1-2]。kras突變與腫瘤靶向治療的耐藥性密切相關(guān)，例如非小細(xì)胞肺癌 (Non-small cell lung cancer，NSCLC) 中的kras基因突變會(huì)導(dǎo)致對(duì)吉非替尼、厄洛替尼等EGFR靶向藥物耐藥，因此kras突變檢測(cè)可用于指導(dǎo)靶向藥物的個(gè)體化治療和用于治療過程中的耐藥監(jiān)測(cè)[3-4]。目前的突變檢測(cè)技術(shù)大都以腫瘤組織為主要檢測(cè)標(biāo)本，由于腫瘤組織的異質(zhì)性[5]，突變檢測(cè)往往需要在較高野生型基因背景下進(jìn)行，因此需要一種高特異性的檢測(cè)方法，以減少假陽性檢測(cè)結(jié)果的產(chǎn)生。液態(tài)活檢樣本例如血液由于取樣方便是更為理想的突變檢測(cè)樣本[6]，已有研究[7-10]發(fā)現(xiàn)血漿游離DNA中存在腫瘤來源的DNA，其突變情況與腫瘤組織高度一致，循環(huán)血突變檢測(cè)被認(rèn)為是一種較有前途的無創(chuàng)檢測(cè)方法，既適用于不適宜手術(shù)的肺癌和結(jié)直腸癌等癌癥患者，也適用于對(duì)病人的突變情況進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)，具有更廣的應(yīng)用范圍。但癌癥病人血漿游離DNA水平較正常人往往明顯升高，kras突變基因所占比例通常較低，很多情況下達(dá)不到1%，為了增加突變檢測(cè)的準(zhǔn)確性，需要靈敏度和特異性高的檢測(cè)方法。目前已有的kras突變檢測(cè)方法包括Sanger測(cè)序法、等位基因特異性PCR (AS PCR，也稱ARMS PCR)[11]、高分辨率溶解曲線分析法[12]、scorpion ARMS[13]、包含焦磷酸測(cè)序在內(nèi)的第二代測(cè)序[14-15]、BEAMing技術(shù)[16]以及數(shù)字PCR技術(shù)[17]。除了最后3種檢測(cè)技術(shù)，大部分突變檢測(cè)技術(shù)的突變檢測(cè)靈敏度都在1%-5%。BEAMing技術(shù)、第二代測(cè)序和數(shù)字PCR技術(shù)雖然突變檢測(cè)靈敏度較高 (甚至可達(dá)到0.000 5%)，但在實(shí)際應(yīng)用中存在一些限制，需要一般臨床實(shí)驗(yàn)室所不具備的特殊儀器，價(jià)格昂貴，樣品制備、操作比較費(fèi)時(shí)。熒光定量qPCR方法作為快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，仍然具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值，ARMS PCR是目前比較常用的qPCR檢測(cè)方法，有研究[18-21]通過在ARMS PCR的基礎(chǔ)上引入野生型等位基因特異性封閉引物的方法來抑制野生型基因的擴(kuò)增，從而改善點(diǎn)突變檢測(cè)的選擇性可以達(dá)到0.1%。文中在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上綜合采用多種技術(shù)方法對(duì)ARMS技術(shù)作了進(jìn)一步改進(jìn)，命名為Tm值相關(guān)的封閉ARMS (Tm-related blocking ARMS，TB-ARMS)技術(shù)，建立了針對(duì)kras基因8種常見點(diǎn)突變的檢測(cè)方法，通過與廣泛使用的商品化試劑盒進(jìn)行比較，及對(duì)臨床組織和配對(duì)血漿樣本的檢測(cè)來驗(yàn)證該方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 基因組DNA和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

研究采用經(jīng)測(cè)序證實(shí)為野生型kras基因的健康人全血基因組DNA作為野生型模板?；蚪MDNA的提取采用天根生化科技有限公司的血液、細(xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒 (目錄號(hào)：DP304-02)，具體操作按照說明書進(jìn)行。本研究所采用的突變標(biāo)準(zhǔn)品為采用基因重組技術(shù)構(gòu)建的kras突變質(zhì)粒，設(shè)計(jì)并采用pCR Blunt Ⅱ TOPO質(zhì)粒載體 (Invitrogen)，構(gòu)建8種常見突變類型的kras突變質(zhì)粒，包括G12C、G12V、G12D、G12R、G12S、G12A、G13C和G13D，并經(jīng)測(cè)序證實(shí)突變序列。kras8種突變質(zhì)粒分別采用BamHⅠ限制性內(nèi)切酶單酶切使其線性化，并割膠回收，采用PCR膠回收試劑盒純化?；蚪MDNA和線性化質(zhì)粒分別采用分光光度計(jì)測(cè)定濃度，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制OD260/280=1.6-1.8。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

本研究中通過將線性化突變質(zhì)粒系列稀釋至10 000、1 000、100和10 copies/μL，然后分別取10 μL與90 μL野生型人基因組DNA (30 ng/μL)混合制備10%、1%、0.1%和0.01%不同突變率的樣品。

1.3 腫瘤組織樣品及血漿樣品的收集和處理

40例NSCLC病人組織樣品由上海市肺科醫(yī)院提供，均為術(shù)后新鮮腫瘤組織樣品；收集20例NSCLC病人術(shù)前血漿樣本和配對(duì)組織樣本，樣品收集后均-80 ℃保存?zhèn)溆谩＝M織DNA的提取采用天根生化科技有限公司的血液、細(xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒，血漿DNA的提取采用天根生化科技有限公司的血清/血漿游離DNA提取試劑盒 (目錄號(hào)：DP339)，具體操作按照說明書進(jìn)行。

1.4 新的kras突變檢測(cè)方法的建立

為了準(zhǔn)確有效地檢測(cè)到大量野生型基因背景下稀少的kras突變基因，組合使用多種手段，以增強(qiáng)ARMS-PCR對(duì)較低突變率突變基因的檢測(cè)靈敏度，增大突變型等位基因特異性引物對(duì)突變型等位基因模板與野生型等位基因模板的區(qū)分能力。使用的手段包括：1) 應(yīng)用野生型等位基因特異性封閉引物，其被設(shè)計(jì)為與野生型等位基因互補(bǔ)，3?端經(jīng)磷酸化修飾；2) 突變型等位基因特異性引物3?端倒數(shù)第4-6位引入錯(cuò)配堿基；3) 突變富集擴(kuò)增的反應(yīng)條件，采用較高退火溫度的預(yù)循環(huán)，該溫度條件下僅有突變模板能被結(jié)合擴(kuò)增，突變模板被富集，然后采用較低退火溫度的循環(huán)進(jìn)行高效擴(kuò)增。

1.4.1 引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增

本研究針對(duì)kras基因12和13號(hào)外顯子上8種常見突變類型，包括c.34G>A (p.G12S)、c.34G>T(p.G12C)、c.34G>C (p.G12R)、c.35G>T (p.G12V)、c.35G>A (p.G12D)、c.35G>C (p.G12A)、c.37G>T (p.G13C)和 c.38G>A (p.G13D)的點(diǎn)突變，采用Oligo 7軟件輔助設(shè)計(jì)ARMS-PCR等位基因特異性引物，并控制其Tm值，以便篩選出與富集擴(kuò)增反應(yīng)條件相適應(yīng)的最佳引物。采用的富集擴(kuò)增反應(yīng)條件較高退火溫度為64 ℃，設(shè)計(jì)突變特異性引物時(shí)控制引物的Tm值范圍為50-60 ℃。封閉引物序列與野生型等位基因位點(diǎn)完全匹配，包括引入修飾的堿基，封閉引物Tm值要大于等于退火溫度，確保其在退火時(shí)與野生型模板結(jié)合起封閉作用，并且封閉引物3?末端經(jīng)修飾，使其在DNA聚合酶作用下不能被延伸。同時(shí)設(shè)計(jì)鎖核酸修飾封閉引物，可使引物Tm值增加5-10 ℃，修飾堿基為kras突變等位基因?qū)?yīng)的野生型基因，以增強(qiáng)封閉引物對(duì)野生型等位基因的區(qū)分能力。封閉引物3?末端堿基采用磷酸化修飾。由于8種點(diǎn)突變位點(diǎn)在外顯子上的位置靠近，因此可采用相同的封閉引物。同時(shí)采用beta-actin基因作為內(nèi)參照基因，對(duì)其設(shè)計(jì)常規(guī)引物探針，用以對(duì)反應(yīng)的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。所有引物、探針均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。本研究所采用的引物探針序列見表1。

檢測(cè)儀器采用ABI 7500熒光定量PCR儀。熒光定量PCR反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系，包括1×TaqHS酶 (TaKaRa) PCR反應(yīng)液、200 nmol/L上游引物和對(duì)應(yīng)的下游引物、400 nmol/L封閉引物、200 nmol/L的Taqman探針、100 nmol/L內(nèi)參照引物、200 nmol/L內(nèi)參照探針，突變富集擴(kuò)增反應(yīng)條件設(shè)定為：95 ℃變性5 min，然后10個(gè)預(yù)循環(huán) (95 ℃ 10 s，64 ℃ 1 min)，再運(yùn)行35個(gè)循環(huán)(95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min)。第三步退火時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。內(nèi)參照引物探針包含在每個(gè)反應(yīng)體系中。

表1 研究中所采用的引物探針序列Table 1 Sequences of primers and probes in this study

1.4.2 封閉引物增強(qiáng)kras點(diǎn)突變檢測(cè)特異性的驗(yàn)證

以kras基因G34A、G35A突變檢測(cè)為例，分別采用含有和不含有封閉引物的反應(yīng)體系對(duì)突變率0、0.01%、0.1%、1%和10%的樣品進(jìn)行檢測(cè)，除封閉引物其余組分完全相同，通過△Ct值 (即Ctwild-Ctmut) 的比較確定封閉引物對(duì)kras突變檢測(cè)特異性是否有改善，△Ct值越大說明檢測(cè)特異性越好。

1.4.3 引入適當(dāng)突變堿基增強(qiáng)等位基因特異性引物檢測(cè)特異性的驗(yàn)證

通過在krasG34A、G34T和G38A等位基因特異性引物3?端倒數(shù)第4–6位引入適當(dāng)突變堿基并調(diào)整Tm值對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，并與未引入突變堿基的等位基因特異性引物對(duì)同樣的野生型模板、0.01%和0.1%突變率的樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過△Ct值 (即Ctwild-Ctmut) 的比較確定每種突變類型的最佳突變等位基因特異性引物，△Ct值越大說明引物的檢測(cè)特異性越好。

1.4.4 突變富集擴(kuò)增反應(yīng)條件與常規(guī)反應(yīng)條件的比較

對(duì)kras-G34A、kras-G35A的引物探針組合分別采用富集擴(kuò)增的反應(yīng)條件和常規(guī)反應(yīng)條件對(duì)相同的135 ng野生型樣品、0.01%和1%突變率的樣品進(jìn)行檢測(cè)比較。富集擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后10個(gè)預(yù)循環(huán) (95 ℃ 10 s，64 ℃1 min)，再運(yùn)行35個(gè)循環(huán) (95 ℃ 10 s，60 ℃1 min)，第三步退火時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。對(duì)比反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性5 min，然后10個(gè)預(yù)循環(huán)(95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min)，再運(yùn)行35個(gè)循環(huán)(95 ℃10 s，60 ℃ 1 min)，第三步退火時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。通過△Ct值 (即Ctwild-Ctmut) 的比較確定最佳反應(yīng)條件，△Ct值越大說明檢測(cè)特異性越好。

1.5 方法學(xué)評(píng)估

1.5.1 突變檢測(cè)特異性分析

采用經(jīng)測(cè)序證實(shí)為野生型的人全血基因組DNA樣本，分別對(duì)3個(gè)不同量 (1 ng、20 ng、135 ng)的野生型模板進(jìn)行kras突變分型檢測(cè)，每樣品重復(fù)3次。PCR擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)施方法和條件如前所述。反應(yīng)結(jié)束，獲得每個(gè)樣品的突變檢測(cè)Ct值和內(nèi)控Ct值。

1.5.2 突變檢測(cè)靈敏度的評(píng)價(jià)

本研究通過在135 ng野生型基因組DNA背景下，對(duì)kras8種突變的每種突變類型采用TB-ARMS qPCR方法檢測(cè)其0.1%和0.01%突變率的樣品，以野生型樣品作對(duì)照，來分析kras突變檢測(cè)的靈敏度。

1.5.3 兩種檢測(cè)方法對(duì)組織樣品的檢測(cè)比較

對(duì)40例NSCLC患者組織樣品提取DNA，每樣品分別取10 ng DNA，采用本研究的TB-ARSM技術(shù)和商品化ADx-ARMSkras突變檢測(cè)試劑盒進(jìn)行分型檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致的樣品進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.5.4 血漿和配對(duì)組織樣品的對(duì)照分析

為驗(yàn)證本研究方法對(duì)血漿DNAkras突變檢測(cè)的準(zhǔn)確性，對(duì)20例NSCLC患者血漿及其配對(duì)組織樣品提取的DNA進(jìn)行對(duì)照分析。采用本研究的TB-ARMS技術(shù)方法對(duì)血漿DNA進(jìn)行8種kras突變分型檢測(cè)。同時(shí)采用測(cè)序方法對(duì)組織DNA樣品進(jìn)行kras突變檢測(cè)。對(duì)血漿和組織樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，判斷血漿突變檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 封閉引物增強(qiáng)kras基因點(diǎn)突變檢測(cè)的特異性

通過對(duì)krasG34A和G35A點(diǎn)突變的檢測(cè)，結(jié)果顯示含有或不含有封閉引物內(nèi)控檢測(cè)Ct值相似，而采用封閉引物對(duì)野生型模板突變檢測(cè)的Ct值增大，對(duì)突變樣品突變檢測(cè)的Ct值與不采用封閉引物相似或更低 (圖1)，因而采用封閉引物的△Ct值即Ctwild-Ctmut會(huì)變大，說明封閉引物可改善kras點(diǎn)突變的檢測(cè)特異性。

圖1 封閉引物增強(qiáng)突變檢測(cè)的特異性Fig.1 Enhanced specificity with wild type blocker in mutation detection.(A) Comparison of the results with and without blocker in detection of kras G34A mutation.(B) Comparison of the results with and without blocker in detection of kras G35A mutation.Mutation analysis was performed on wild and mutant samples with reagents (with and without blocker),and each reagent included the primer set for internal positive control.Reactions were run in triplicate and data are shown as average Ct values.Legend “M” represents mutation detection without blocker;“M+B” represents mutation detection with blocker;“IPC” represents internal positive control detection without blocker;and “IPC+B” represents internal positive control detection with blocker.

2.2 突變堿基的引入可提高kras等位基因特異性引物突變檢測(cè)的特異性和選擇性

對(duì)kras突變的引物優(yōu)化結(jié)果 (表2) 表明，kras-G34A等位基因特異性引物3?端倒數(shù)第5位引入突變堿基C>A的等位基因特異性引物G34A-R3較未引入突變堿基的等位基因特異性引物G34A-R1、G34A-R2對(duì)0.1%和0.01%樣品突變檢測(cè)的△Ct值明顯增大；同樣，3?端倒數(shù)第5位引入突變堿基C>A的等位基因特異性引物G34T-R4較3?端未引入突變堿基的等位基因特異性引物的G34T-R1、G34T-R2的△Ct值增大，較Tm值較高的G34T-R3突變檢測(cè)的△Ct值亦增大；而對(duì)于kras-G38A倒數(shù)第6位引入突變堿基C>A的等位基因特異性引物G38A-R4較3?端未引入突變堿基的等位基因特異性引物G38A-R1、G38A-R2的△Ct值增大，較3?端倒數(shù)第5位引入突變堿基T>C的等位基因特異性引物G38A-R5、G38A-R6的△Ct值也增大，較Tm值較高的G38A-R3突變檢測(cè)的△Ct值亦增大，G38A-R4檢測(cè)特異性最好。

2.3 突變富集擴(kuò)增反應(yīng)條件與常規(guī)擴(kuò)增條件的比較

通過采用突變富集擴(kuò)增反應(yīng)條件 (表3) 和常規(guī)擴(kuò)增條件 (表4) 對(duì)kras-G34A和kras-G35A的不同突變樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明采用突變富集擴(kuò)增反應(yīng)條件對(duì)野生型樣品檢測(cè)的Ct值比常規(guī)擴(kuò)增條件的Ct值均增大；采用突變富集擴(kuò)增反應(yīng)條件對(duì)于10%高突變率樣品檢測(cè)，G34A突變檢測(cè)△Ct值與常規(guī)檢測(cè)條件相比增加，而G35A突變檢測(cè)△Ct值與常規(guī)檢測(cè)條件相比無明顯改變；但采用突變富集擴(kuò)增反應(yīng)條件對(duì)0.1%和0.01%低突變率樣品檢測(cè)，G34A和G35A突變檢測(cè)的△Ct值均高于常規(guī)擴(kuò)增條件的△Ct值，數(shù)值至少可增加1以上。

表2 等位基因特異性引物引入適當(dāng)突變堿基可增加突變檢測(cè)特異性Table 2 Introduction of certain mutated base increased the specificity of mutation detection

表3 突變富集反應(yīng)條件下的突變檢測(cè)Table 3 Mutation detection under mutant-enriched condition

表4 常規(guī)反應(yīng)條件下的突變檢測(cè)Table 4 Mutation detection under traditional condition

2.4 突變檢測(cè)特異性分析

通過對(duì)1 ng、20 ng和135 ng野生型基因組DNA的檢測(cè)，觀察每個(gè)樣本的內(nèi)控Ct值均<30 (數(shù)據(jù)未列出)，不同分型試劑對(duì)野生型樣品突變檢測(cè)的Ct值均大于30 (表5)，提示TB-ARMS技術(shù)kras突變分型檢測(cè)在1-135 ng模板范圍內(nèi)，突變檢測(cè)Ct值均小于30。

2.5 突變檢測(cè)的靈敏度評(píng)價(jià)

kras8種分型試劑對(duì)0.01%、0.1%突變率樣品的檢測(cè)結(jié)果(表6)表明，不同分型試劑對(duì)相應(yīng)的0.1%和0.01%突變率樣品的突變檢測(cè)Ct值均小于30，小于相應(yīng)野生型模板檢測(cè)Ct值，且與野生型模板檢測(cè)的Ct值差值即△Ct值均大于3，初步判定本發(fā)明kras分型試劑突變檢測(cè)的靈敏度均可達(dá)到0.01%，分型檢測(cè)0.01%突變檢測(cè)Ct臨界值可取Ctwild和Ct0.01%中間的數(shù)值。

2.6 兩種方法臨床組織樣本檢測(cè)結(jié)果比較

對(duì)40例NSCLC組織樣本提取的DNA，分別采用TB-ARMS技術(shù)和ADx-ARMS技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，其中35例樣品檢測(cè)結(jié)果一致，5例樣品兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致。5例檢測(cè)不一致樣品中2例樣品分型結(jié)果不一致，3例樣品ADx-ARMS商品化試劑盒未檢測(cè)到突變。對(duì)該5例檢測(cè)不一致樣品進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果 (見表7和圖2)表明TB-AMRS技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。

表5 8種kras分型試劑對(duì)野生型樣品的檢測(cè)Ct值Table 5 Ct values of wild type samples with 8 kras genotyping reagents

表6 kras 8種分型檢測(cè)試劑的突變檢測(cè)靈敏度Table 6 The sensitivity of 8 kras typing reagents

表7 5例檢測(cè)不一致樣品三種檢測(cè)方法的結(jié)果比較Table 7 Comparsion of the results of 5 inconsistent samples with three different methods

圖2 五例檢測(cè)不一致樣品的TB-ARMS qPCR檢測(cè)結(jié)果和測(cè)序結(jié)果Fig.2 TB-ARMS qPCR results and sequencing results of five inconsistent samples.

2.7 血漿及配對(duì)組織DNA樣品檢測(cè)結(jié)果比較

血漿DNA檢測(cè)結(jié)果與配對(duì)組織樣品測(cè)序結(jié)果的比較見表8和圖3，表明血漿DNA樣品檢測(cè)結(jié)果與配對(duì)組織樣品測(cè)序結(jié)果完全一致。

表8 20例NSCLC病人血漿DNA樣品kras突變qPCR檢測(cè)結(jié)果Table 8 The qPCR results of kras mutation for 20 NSCLC plasma DNA samples

3 討論

當(dāng)使用基于PCR方法的kras基因突變檢測(cè)時(shí)，樣本中的突變型等位基因的擴(kuò)增會(huì)被野生型基因干擾，尤其在高野生型基因背景下檢測(cè)稀少的突變時(shí)，突變型等位基因特異性引物會(huì)錯(cuò)配至野生型等位基因并發(fā)生延伸，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。目前常用的kras點(diǎn)突變檢測(cè)PCR方法大都為ARMS方法及其改進(jìn)的技術(shù)方法，原理都是通過等位基因特異性引物3?末端的特異性堿基區(qū)分突變和野生型kras基因。僅通過ARMS方法對(duì)點(diǎn)突變的檢測(cè)靈敏度只能達(dá)到1%，即最低只能檢測(cè)到1%突變率的樣品。而對(duì)于大量野生型基因背景下的稀少突變，例如0.1%突變率的樣品，ARMS技術(shù)方法的應(yīng)用將受到限制。高野生型背景下稀少的突變檢測(cè)依賴于抑制樣品中野生型等位基因的擴(kuò)增，不少研究[18-21]均已證明野生型等位基因特異性封閉引物有助于增加突變檢測(cè)的特異性，我們的研究也作了進(jìn)一步驗(yàn)證，采用封閉引物krasG34A和G35A突變檢測(cè)的靈敏度和特異性均可獲得改善，甚至提高到10倍。有研究對(duì)封閉引物進(jìn)一步采用MGB修飾或鎖核酸修飾來增加其Tm值從而增強(qiáng)其封閉效果，雖然這樣可增強(qiáng)其結(jié)合能力但引物合成的成本較單純磷酸化修飾大大增加并對(duì)突變檢測(cè)亦產(chǎn)生抑制。例如Huang等[22]采用6個(gè)鎖核酸修飾堿基的WTB封閉引物，明顯提高了WTB的Tm值，對(duì)野生型模板的封閉能力顯著增強(qiáng)，但亦需要采用較長的36堿基的等位基因特異性引物以增加其Tm值可與WTB競(jìng)爭(zhēng)，減少WTB對(duì)突變檢測(cè)的抑制，均使其應(yīng)用成本增加。本研究的封閉引物僅3?末端進(jìn)行磷酸化修飾或采用3個(gè)鎖核酸修飾堿基，其亦可以達(dá)到較好的檢測(cè)效果，具有更高的性價(jià)比。

圖3 突變陽性組織樣品測(cè)序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of mutant tissue samples.

同時(shí)對(duì)含有野生型等位基因樣品中的突變型等位基因的特異性檢測(cè)依賴于對(duì)突變型等位基因的選擇性擴(kuò)增，等位基因特異性引物3?端僅有一個(gè)區(qū)分堿基有時(shí)不足以抑制野生型模板的結(jié)合，在靠近3?端的適當(dāng)位置再人為引入一個(gè)突變堿基，會(huì)進(jìn)一步降低野生型模板的結(jié)合能力。Xue等[23]的研究即采用引入錯(cuò)配堿基的方法改善了基因分型檢測(cè)中等位基因特異性引物的檢測(cè)特異性，我們的研究也表明通過引入適當(dāng)突變堿基可改善某些kras突變等位基因特異性引物的檢測(cè)特異性，如果擴(kuò)增效率按100%計(jì)算，最高可改善達(dá)10倍。

此外，通過富集擴(kuò)增的反應(yīng)條件我們亦改善了kras突變檢測(cè)的特異性，與常規(guī)檢測(cè)條件相比，我們的富集擴(kuò)增反應(yīng)條件對(duì)0.01%和0.1%低突變率樣品檢測(cè)的△Ct值可增加至少1，如果擴(kuò)增效率按100%計(jì)算，則我們的富集擴(kuò)增條件可使突變檢測(cè)特異性改善2倍以上。

通過采用多種組合手段，文中的TB-ARMS技術(shù)kras點(diǎn)突變檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到0.01%，較單純ARMS方法檢測(cè)靈敏度可提高100倍以上。與現(xiàn)有商品化試劑盒相比具有更高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，證明了TB-ARMS技術(shù)檢測(cè)靈敏度優(yōu)于單純的ARMS技術(shù)方法。此外我們的研究方法對(duì)模板具有更廣的檢測(cè)范圍，模板量10–135 ng不影響突變檢測(cè)的特異性，并且由于檢測(cè)特異性的改善可在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行kras多種點(diǎn)突變的同時(shí)檢測(cè)，因此在實(shí)際應(yīng)用中將會(huì)更加方便。

液態(tài)活檢作為伴隨診斷的無創(chuàng)檢測(cè)方法受到越來越多的關(guān)注，成為研究的熱點(diǎn)之一，血液是最常用的液態(tài)活檢樣品。已有研究[24]表明肺癌組織樣品中常常存在低突變率的kras突變，血液中的kras突變率可能會(huì)更低，甚至不到0.1%的突變率。現(xiàn)有的ARMS檢測(cè)技術(shù)受靈敏度限制不適宜血液等樣品的檢測(cè)，TB-ARMS技術(shù)突變檢測(cè)的靈敏度大大提高，通過對(duì)20例術(shù)前血漿樣本和配對(duì)組織樣品的對(duì)照檢測(cè)，兩者檢測(cè)結(jié)果的一致亦驗(yàn)證了TB-ARMS技術(shù)方法的檢測(cè)準(zhǔn)確性，適用于液體活檢樣本的檢測(cè)。

除了應(yīng)用于kras基因點(diǎn)突變的檢測(cè)，TB-ARMS突變檢測(cè)方法只要遵循相應(yīng)的引物設(shè)計(jì)原則和應(yīng)用方法，理論上適用于所有野生型背景下的基因點(diǎn)突變檢測(cè)，例如可應(yīng)用于與癌癥個(gè)體化治療和預(yù)后預(yù)測(cè)相關(guān)的braf、pi3k、tp53等其他基因的點(diǎn)突變檢測(cè)[25-26]，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。隨著基因突變檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，雖然出現(xiàn)了一系列高靈敏度的突變檢測(cè)方法，包括第二代測(cè)序技術(shù)、數(shù)字化PCR等，相較于這些高成本的檢測(cè)方法，改進(jìn)的TB-ARMS熒光PCR點(diǎn)突變檢測(cè)方法具有低成本、簡(jiǎn)單方便的應(yīng)用特點(diǎn)，檢測(cè)時(shí)間只需大約1.5 h，在熒光定量PCR儀臨床應(yīng)用已經(jīng)十分普及的今天，更適宜在臨床檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。