朱燕，韓小韋，牛毅男，鄭蓓，李學(xué)俊，徐全樂，陳鵬

西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100

分子克隆技術(shù)通常使用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶實(shí)現(xiàn)DNA的體外克隆，載體多克隆位點(diǎn)有限的酶切位點(diǎn)和DNA分子內(nèi)部存在的酶切位點(diǎn)限制了該方法的通用性和可操作性[1-2]。不依賴連接酶的克隆方法 (Ligase independent cloning，LIC)即無(wú)縫克隆技術(shù)的出現(xiàn)大大提高了體外DNA重組克隆的效率。LIC通過特定的DNA外切酶使兩個(gè)DNA分子產(chǎn)生可互補(bǔ)的單鏈末端，單鏈末端的退火推進(jìn)DNA發(fā)生重組，這種重組克隆的方式不受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制，使基因克隆的操作更靈活，可滿足高通量DNA克隆的需求[3-5]。

目前不依賴連接酶克隆系統(tǒng)用于形成DNA單鏈末端的酶主要有核酸外切酶Ⅲ、T4 DNA聚合酶、λ核酸外切酶等。核酸外切酶Ⅲ具有3?-5?核酸外切酶活性，已有的研究顯示，使用適量的核酸外切酶Ⅲ處理載體和片段30–60 s即可產(chǎn)生有效的末端同源臂[6]。核酸外切酶Ⅲ對(duì)存在3?單鏈末端的dsDNA無(wú)外切活性，因此由形成3?單鏈末端的限制性內(nèi)切酶 (如PstⅠ) 制備的DNA無(wú)法選擇該體系進(jìn)行克隆[7]。T4 DNA聚合酶具有3?-5?核酸外切酶活性，且在dNTPs存在條件下可以催化DNA的合成，使用該酶處理目的片段和載體可產(chǎn)生5?單鏈末端，經(jīng)退火復(fù)性即可實(shí)現(xiàn)重組[8]。然而由于T4 DNA聚合酶外切活性強(qiáng)且具有持續(xù)性，因此容易對(duì)雙鏈DNA造成過度外切而產(chǎn)生過長(zhǎng)的單鏈末端，長(zhǎng)的末端容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而抑制有效的重組反應(yīng)[9-10]。λ核酸外切酶是一種噬菌體來(lái)源的5?-3?核酸外切酶，可使載體和目的片段產(chǎn)生3?單鏈末端促進(jìn)重組反應(yīng)[11]，然而λ核酸外切酶的最適底物是5?磷酸化的dsDNA，對(duì)于通過PCR制備的載體和PCR產(chǎn)物外切效率極低，因此λ核酸外切酶用于體外的重組反應(yīng)時(shí)存在作用底物上的巨大局限[12-13]。除了上述酶系統(tǒng)外，大腸桿菌RecA重組系統(tǒng)也被用于體外的重組反應(yīng)，該系統(tǒng)利用RecBCD的解旋酶和5?-3?外切酶活性產(chǎn)生3?單鏈末端，在RecA的作用下完成重組。但該體系不僅需要較為復(fù)雜的蛋白因子和輔因子 (如ATP等)，而且需要151 bp以上的同源區(qū)才能實(shí)現(xiàn)有效的重組，體外條件下超長(zhǎng)的同源區(qū)不僅增加單鏈末端自身形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的概率，同時(shí)增加引物合成的成本和出錯(cuò)率[14-16]。

大腸桿菌核酸外切酶Ⅷ (Exonuclease Ⅷ，Exo Ⅷ)是一種不依賴ATP的dsDNA 5?-3?核酸外切酶，在37 ℃的反應(yīng)條件下表現(xiàn)為持續(xù)性的底物外切活性，即造成所結(jié)合的特定DNA鏈的連續(xù)外切，而在10 ℃的反應(yīng)條件下對(duì)線性雙鏈DNA外切表現(xiàn)為分配性，即反應(yīng)體系中形成具有較為均一長(zhǎng)度3?單鏈的DNA。Exo Ⅷ對(duì)5?磷酸化和非磷酸化的雙鏈DNA具有相同的外切效率[17-18]。Chang等報(bào)道大腸桿菌Exo Ⅷ C端分子量約為34 kDa的截短體保留了完整的5?-3?外切酶活性，且具有與98 kDa完整酶相同的催化特性[19]。Zhang等報(bào)道在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)Rac噬菌體Exo Ⅷ和RecT蛋白可以實(shí)現(xiàn)外源線性化的DNA和環(huán)狀載體在大腸桿菌體內(nèi)的高效重組，反應(yīng)需要35–60 bp的同源臂[20-21]。目前Exo Ⅷ主要用于去除環(huán)狀雙鏈DNA或環(huán)狀ssDNA中的線性dsDNA，而利用Exo Ⅷ外切活性介導(dǎo)體外DNA重組的研究至今尚未見報(bào)道。

本研究在重組表達(dá)和純化具完整外切活性的Exo Ⅷ截短體 (Truncated exonuclease Ⅷ，tExo Ⅷ)的基礎(chǔ)上，對(duì)tExo Ⅷ介導(dǎo)體外重組的可行性及反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，為建立基于tExo Ⅷ的高效體外重組體系奠定基礎(chǔ)工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體

本研究采用的菌株大腸桿菌Escherichia coliMach1 T1、BL21 Star (DE3) 以及質(zhì)粒pET28a、pYES2等均為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基 (1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂，pH 7.0) 用于培養(yǎng)大腸桿菌。

1.1.3 酶和試劑

2× IProof DNA polymerase Mix購(gòu)自Bio-Rad公司；TaqDNA聚合酶、Pfu DNA polymerase購(gòu)自Promega公司；NdeI、XhoI、Hind III、XbaI、T4 DNA Ligase購(gòu)自Thermo Scientific公司；dNTPs購(gòu)自Roche公司；Talon resin購(gòu)自Clontech公司。

1.1.4 感受態(tài)細(xì)胞

參考Chung等的方法采用TSS法大量制備Mach1 T1感受態(tài)細(xì)胞[22]。采用KCM法轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pUC18檢測(cè)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率為2.2×106CFU/μg[23]。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴(kuò)增

根據(jù)tExo Ⅷ序列利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)并合成引物序列EXO8-1和EXO8-2 (表1)，并以大腸桿菌TOP10基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

tExo Ⅷ的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a分別用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收純化，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Mach1 T1感受態(tài)細(xì)胞，利用TaqDNA聚合酶，并以EXO8-1和EXO8-2為引物進(jìn)行菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆并測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pET28a-tExo Ⅷ。

1.2.3 tExo Ⅷ的表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒pET28a-tExo Ⅷ轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株E.coliBL21 Star (DE3) 中，挑取單菌落接種于5 mL含50 μg/mL卡那霉素 (Kana) 的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)過夜。按1∶100的比例接種菌液于200 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值為1.0，加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG，30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)8 h。取1 mL菌液，10 000 r/min離心5 min，棄上清，同時(shí)以未加入IPTG的菌體作為對(duì)照。將菌體懸浮于100 μL SDS-PAGE上樣緩沖液中，100 ℃煮沸5 min，離心取上清，使用SDS-PAGE (分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為4%)檢測(cè)tExo Ⅷ重組蛋白的表達(dá)。

將誘導(dǎo)的菌體懸浮于破菌緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，pH 7.5) 中進(jìn)行超聲波破碎，裂解液在12 000 r/min離心10 min，分別取上清和沉淀按上述方法進(jìn)行SDS-PAGE分析，以檢測(cè)表達(dá)蛋白的可溶性[24]。

參考Mitsudome等的方法用鈷離子螯合層析柱 (Talon Resin，Clontech) 對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離純化[25]。洗脫的目的蛋白用截留分子量為10 kDa的超濾管進(jìn)行濃縮，SDS-PAGE檢測(cè)純化蛋白的純度。蛋白濃度的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G250法，用牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.tExo Ⅷ活性的測(cè)定

參照Ko等的方法[26]，酶活力單位定義為50 μL反應(yīng)體系，37 ℃、30 min生成1 nmol核苷酸所需的酶量。以線性化pGEX-6P-1質(zhì)粒DNA為底物。反應(yīng)體系為：冰浴條件下在PCR管中加入5 μL 10×反應(yīng)緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl，100 mmol/L MgSO4，10 mmol/L DTT，pH 8.0)，10 μg線性化pGEX-6P-1質(zhì)粒及純化的tExo Ⅷ并用ddH2O補(bǔ)充體積至50 μL，混勻，37 ℃保溫30 min。反應(yīng)結(jié)束后，加1/4體積1 mol/L HCl，并用25% TCA終止反應(yīng)。上清用滅菌ddH2O稀釋，測(cè)定260 nm處光吸收值。

1.2.5 tExo Ⅷ介導(dǎo)的體外重組反應(yīng)的可行性

為驗(yàn)證tExo Ⅷ進(jìn)行體外重組的可行性，以經(jīng)Hind Ⅲ/XbaⅠ雙酶切線性化的pYES2質(zhì)粒為載體，苦蕎抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白 3(Natural resistanceassociated macrophage protein 3，Nramp3)、ABC(ATP-binding cassette，ABC) 家族G11蛋白、ABC家族B1蛋白的基因片段nramp3 (1 000 bp)、g11(2 200 bp)、b1 (4 000 bp) 為克隆目標(biāo)進(jìn)行tExo Ⅷ介導(dǎo)的體外重組反應(yīng)。

pYES2質(zhì)粒的制備及目的基因的PCR擴(kuò)增：使用質(zhì)粒抽提試劑盒 (TIANprep Mini Plasmid Kit) 提取pYES2質(zhì)粒，經(jīng)Hind III和XbaI雙酶切后回收。用引物pYES2-Nramp3-F和pYES2-Nramp3-R擴(kuò)增nramp3目的片段 (同源臂長(zhǎng)度為21 bp)，pYES2-B1-F和pYES2-B1-R擴(kuò)增b1目的片段(同源臂長(zhǎng)度為21 bp)，分別用pYES2-G11(21)-F和pYES2-G11(21)-R、pYES2-G11(17)-F和pYES2-G11(17)-R、pYES2-G11(13)-F和 pYES2-G11(13)-R、pYES2-G11(8)-F和pYES2-G11(8)-R擴(kuò)增同源臂長(zhǎng)度分別為21、17、13、8 bp的g11目的片段。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

tExo Ⅷ介導(dǎo)的體外重組反應(yīng)的可行性：基于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在10 μL的重組體系中加入2.5 U的tExo Ⅷ即可完成有效的重組。按照載體和重組基因片段摩爾比值1∶3的比例取對(duì)應(yīng)量的線性化載體pYES2 (5 856 bp) 和nramp3 (1 000 bp)，加入5 μL 含有 tExo Ⅷ的重組反應(yīng)液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5，40 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT，5 mmol/L MgCl2，2.5 U tExo Ⅷ)，用ddH2O補(bǔ)足體系至10 μL后進(jìn)行重組反應(yīng)。分別在25 ℃、30 ℃外切反應(yīng)10 min，重組反應(yīng)液冰浴后用KCM法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Mach1 T1感受態(tài)細(xì)胞[23]，根據(jù)平板的克隆數(shù)、PCR及雙酶切鑒定評(píng)價(jià)重組的可行性。PCR鑒定采用基因特異性引物進(jìn)行。每個(gè)重組反應(yīng)至少重復(fù)3次。

1.2.6 體外同源臂延伸對(duì)于重組效率的影響

參考1.2.5的方法和體系，在重組反應(yīng)體系中添加dNTPs和PfuDNA 聚合酶，形成在體外條件下單鏈同源臂區(qū)的延伸，即按照載體和重組基因片段摩爾比值1∶3的比例取對(duì)應(yīng)量的線性化載體pYES2 (5 856 bp) 和nramp3 (1 000 bp)，加入5 μL含有tExo Ⅷ的重組反應(yīng)液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5，40 mmol/L KCl，500 μmol/L dNTPs，1 mmol/L DTT，5 mmol/L MgCl2，2.5 U tExo Ⅷ，1 U Pfu DNA聚合酶)，用ddH2O補(bǔ)足體系至10 μL后進(jìn)行重組反應(yīng)。分別在25 ℃、30 ℃外切反應(yīng)10 min后，50 ℃保溫50 min延伸同源臂。重組反應(yīng)液經(jīng)冰浴后使用KCM法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Mach1 T1感受態(tài)細(xì)胞[23]，根據(jù)平板的克隆數(shù)、PCR及雙酶切鑒定評(píng)價(jià)重組效率，每個(gè)重組反應(yīng)至少重復(fù)3次。

1.2.7 外切反應(yīng)溫度對(duì)重組效率的影響

參考1.2.6的重組反應(yīng)體系，分別在0 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃外切反應(yīng)10 min后，50 ℃保溫50 min延伸同源臂。重組反應(yīng)液冰浴后用KCM法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Mach1 T1感受態(tài)細(xì)胞[23]，根據(jù)平板的克隆數(shù)、PCR及雙酶切鑒定評(píng)價(jià)重組效率，每個(gè)重組反應(yīng)至少重復(fù)3次。

1.2.8 外切反應(yīng)時(shí)間對(duì)重組效率的影響

參考1.2.6的反應(yīng)體系，分別在25 ℃、30 ℃外切反應(yīng)5、7.5、10、12.5 min，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Mach1 T1感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)平板的克隆數(shù)、PCR及雙酶切鑒定評(píng)價(jià)重組效率。

1.2.9 基因片段大小對(duì)體外重組反應(yīng)效率的影響

參考1.2.6的反應(yīng)體系，在25 ℃、12.5 min和50 ℃、50 min的反應(yīng)條件下將載體和目的片段按摩爾比值1∶3的比例取對(duì)應(yīng)量的線性化載體pYES2(5 856 bp)，分別與nramp3 (1 000 bp)、g11 (2 200 bp)、b1 (4 000 bp)基因片段進(jìn)行重組反應(yīng)，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Mach1 T1感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)平板的克隆數(shù)、PCR及雙酶切鑒定評(píng)價(jià)重組效率。每個(gè)重組反應(yīng)至少重復(fù)3次。

1.2.10 同源臂長(zhǎng)度對(duì)重組效率的影響

將載體和目的片段按摩爾比值1∶3的比例取對(duì)應(yīng)量的線性化載體pYES2和純化的同源臂長(zhǎng)度分別為21、17、13、8 bp的g11目的片段，參考1.2.6的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行重組反應(yīng)，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Mach1 T1感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)平板的克隆數(shù)、PCR及雙酶切鑒定評(píng)價(jià)重組效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 Exo Ⅷ截短體基因的擴(kuò)增和重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以EXO8-1和EXO8-2為引物擴(kuò)增目的基因tExoⅧ，電泳結(jié)果顯示約為900 bp的單一條帶 (圖1A)，大小與預(yù)期基因片段大小相符。

使用NdeI、XhoI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示分別為約5 300 bp的載體及約900 bp的目的基因條帶 (圖1B)，與預(yù)期結(jié)果相符。測(cè)序結(jié)果顯示構(gòu)建的表達(dá)載體正確，將其命名為pET28a-tExo Ⅷ。

2.2 tExo Ⅷ表達(dá)與純化

重組質(zhì)粒pET28a-tExo Ⅷ轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 Star (DE3)，0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)8 h的菌體經(jīng)超聲細(xì)胞破碎，上清液通過鈷離子螯合層析進(jìn)行純化。SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)的菌體及純化蛋白，如圖2所示，誘導(dǎo)的菌體較未誘導(dǎo)的樣品在約38 kDa位置出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，與tExo Ⅷ蛋白的理論分子量大小一致，經(jīng)鈷離子柱純化獲得與之分子量一致的單一條帶。每升誘導(dǎo)的菌液可純化92.40 mg的tExo Ⅷ，比活力為1.21×105U/mg。

2.3 tExo Ⅷ介導(dǎo)體外重組反應(yīng)的可行性

圖1 Exo Ⅷ截短體基因的克隆(A)及pET28a-tExoⅧ重組載體的雙酶切鑒定(B)Fig.1 PCR amplification of truncated Exo Ⅷ gene (A)and double digestion of pET28a-tExo Ⅷ (B).(A) M:DL2000 DNA marker;1:PCR product of tExo Ⅷ.(B) M:DL2000 DNA marker;1,2:double digested pET28atExo Ⅷ.

圖2 tExo Ⅷ表達(dá)與純化的SDS-PAGE分析Fig.2 Expression and purification of tExo Ⅷanalyzed by SDS-PAGE.M:protein marker;1:purified tExo Ⅷ;2:induced cells containing pET28a-tExo Ⅷ;3:non-induced cells containing pET28a-tExo Ⅷ.

以同源臂長(zhǎng)度為21 bp，1 kbnramp3基因?yàn)椴迦肫危?5 ℃、30 ℃外切反應(yīng)10 min，每微克載體可分別形成2 640、5 181個(gè)克隆，陽(yáng)性率檢測(cè)顯示均達(dá)到80%。結(jié)果表明tExo Ⅷ介導(dǎo)的體外重組反應(yīng)存在有效性和可行性。

2.4 體外同源臂延伸及反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)重組效率的影響

2.4.1 體外同源臂延伸對(duì)tExo Ⅷ重組效率的影響

以同源臂長(zhǎng)度為21 bp，1 kbnramp3基因?yàn)椴迦肫危?5 ℃、30 ℃外切反應(yīng)10 min后，利用Pfu DNA聚合酶的聚合活性，50 ℃反應(yīng)50 min進(jìn)行同源臂同源匹配區(qū)的延伸，每微克載體可分別形成10 164、8 346個(gè)克隆，陽(yáng)性率檢測(cè)顯示均大于80%。結(jié)果說明添加Pfu DNA聚合酶可以有效提高tExoⅧ介導(dǎo)體外重組的效率?；诖私Y(jié)果，后續(xù)僅對(duì)于tExo Ⅷ外切反應(yīng)的時(shí)間和溫度進(jìn)行優(yōu)化。

2.4.2 tExo Ⅷ外切反應(yīng)溫度對(duì)重組效率的影響

使用0–37 ℃的外切反應(yīng)溫度及后續(xù)50 ℃、50 min的保溫進(jìn)行重組反應(yīng)，結(jié)果顯示各重組條件下均具有較高的陽(yáng)性率，進(jìn)一步說明利用tExo Ⅷ進(jìn)行體外DNA重組反應(yīng)的可行性。在0–30 ℃范圍內(nèi)，隨著外切反應(yīng)溫度的升高重組效率持續(xù)增加，并且均具有較高的陽(yáng)性率 (表2)。而在37 ℃外切反應(yīng)10 min，重組反應(yīng)的效率明顯下降。結(jié)果表明tExoⅧ用于重組反應(yīng)時(shí)適宜的外切反應(yīng)溫度范圍為25–30 ℃。

2.4.3 外切反應(yīng)時(shí)間對(duì)重組效率的影響

在25 ℃、30 ℃溫度下使用不同外切反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行重組轉(zhuǎn)化，結(jié)果顯示在不加入50 ℃退火反應(yīng)的快速重組中，反應(yīng)條件為25 ℃ 12.5 min、30 ℃10 min時(shí)重組效率最高 (表3)。在這兩種條件下后續(xù)進(jìn)行50 ℃、50 min的同源臂延伸，結(jié)果顯示外切反應(yīng)條件為25 ℃ 12.5 min時(shí)重組效率最高，說明tExo Ⅷ介導(dǎo)的體外重組體系較為適宜的反應(yīng)條件為在25 ℃下反應(yīng)10–12.5 min。

表2 不同外切反應(yīng)溫度對(duì)tExo Ⅷ介導(dǎo)的重組克隆效率的影響Table 2 Effect of different reaction temperatures on tExo Ⅷ-mediated recombinant cloning efficiency (per μg of vector)

表3 不同外切反應(yīng)時(shí)間對(duì)tExo Ⅷ介導(dǎo)的重組克隆效率的影響Table 3 Effect of different reaction duration on tExo Ⅷ-mediated recombinant cloning efficiency (per μg of vector)

2.4.4 基因片段大小對(duì)體外重組反應(yīng)效率的影響

為了分析基于tExo Ⅷ的體外重組體系對(duì)不同長(zhǎng)度基因片段重組效率的差異，在25 ℃、12.5 min和50 ℃、50 min的反應(yīng)條件下使用nramp3 (1 000 bp)、g11 (2 200 bp)、b1 (4 000 bp) 三種不同大小的基因片段進(jìn)行重組克隆。結(jié)果顯示tExo Ⅷ介導(dǎo)的體外重組體系對(duì)于上述基因均可實(shí)現(xiàn)有效克隆，且體系對(duì)于nramp3及g11的重組效率較b1基因高，表現(xiàn)出隨著片段長(zhǎng)度的增加克隆效率下降的趨勢(shì) (表4)。

表4 tExo Ⅷ介導(dǎo)的體外重組體系對(duì)不同長(zhǎng)度DNA片段的克隆效率Table 4 Cloning efficiency of tExo Ⅷ mediated in vitro recombination for different DNA sizes (per μg of vector)

2.4.5 同源臂長(zhǎng)度對(duì)重組反應(yīng)的影響

使用同源臂長(zhǎng)度分別為21、17、13、8 bp的g11基因片段和pYES2線性化載體在25 ℃、12.5 min和50 ℃、50 min的反應(yīng)條件下進(jìn)行重組反應(yīng)，以探究同源臂長(zhǎng)度對(duì)于重組克隆效率的影響。結(jié)果如表5所示，隨著同源臂長(zhǎng)度的增加重組效率增加，同源臂長(zhǎng)度為21、17 bp時(shí)重組效率最高且無(wú)顯著性差異。同源臂長(zhǎng)度為8 bp時(shí)仍可形成有較高陽(yáng)性率的克隆，降低后續(xù)同源臂延伸的反應(yīng)溫度至40 ℃可提高重組效率 (表5)。

3 討論

不依賴于連接酶的無(wú)縫克隆技術(shù)的發(fā)展大大加速了基因克隆的效率和操作通量?，F(xiàn)有的體外重組系統(tǒng)依賴于核酸外切酶Ⅲ、T4 DNA聚合酶、λ核酸外切酶等形成單鏈的同源重組臂[6-9,11-13]。其中，核酸外切酶Ⅲ是3?-5?核酸外切酶，其優(yōu)選底物是平末端或3?凹陷末端，而對(duì)于存在四堿基或更長(zhǎng)的3?單鏈末端的DNA分子無(wú)活性[7]，λ核酸外切酶對(duì)5?去磷酸化的雙鏈DNA表現(xiàn)出低的外切效率 (約為5?磷酸化底物的20%)[27]，T4 DNA聚合酶具有超強(qiáng)外切酶活性，在形成單鏈的同源重組臂時(shí)必須精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間等以防止酶切過度。鑒于上述原因?qū)е卢F(xiàn)有的體外重組體系不同批次的克隆操作效率存在巨大差異，因此拓展新的外切酶種類用于體外重組反應(yīng)中單鏈同源臂的形成具有重要的實(shí)踐價(jià)值。

表5 同源臂長(zhǎng)度對(duì)g11重組克隆效率的影響Table 5 Effect of homology arm lengths on the recombinant cloning efficiency of g11 (per μg of vector)

Exo Ⅷ是一種不依賴于ATP的5?-3?核酸外切酶，在10 ℃的反應(yīng)條件下對(duì)線性雙鏈DNA的外切呈分配性，能有效外切具有長(zhǎng)達(dá)250個(gè)核苷酸的5?單鏈末端的DNA分子，其對(duì)底物的識(shí)別不依賴于雙鏈DNA的5?磷酸基團(tuán)，且對(duì)具5?單鏈末端、平末端、3?單鏈末端的雙鏈底物能以較為一致的效率進(jìn)行外切，這些特性使Exo Ⅷ非常適合于體外DNA重組中均一單鏈同源臂的形成[18]。Exo Ⅷ是體外DNA重組反應(yīng)極具應(yīng)用價(jià)值的候選蛋白，但迄今為止關(guān)于Exo Ⅷ用于體外重組的研究尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。已有文獻(xiàn)報(bào)道Exo Ⅷ的C末端結(jié)構(gòu)域有著完整的核酸外切酶活性[19]，本研究克隆了保留完整外切活性的Exo Ⅷ截短基因 (tExo Ⅷ)，并實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌內(nèi)的重組表達(dá)。tExo Ⅷ表達(dá)量可達(dá)92.40 mg/L，純化酶的比活力可以達(dá)到1.21×105U/mg，按照本研究建立的體系可以用于超過300萬(wàn)次的重組反應(yīng)。

圖7 Exo Ⅷ介導(dǎo)的同源重組體系示意圖Fig.7 Diagram of the homologous recombination system mediated by Exo Ⅷ.

在本研究的重組體系中，引入促進(jìn)體外同源臂延伸的新策略 (圖7)，25 ℃保溫條件下Exo Ⅷ外切雙鏈DNA可能形成長(zhǎng)于設(shè)計(jì)的同源單鏈區(qū)，不同來(lái)源的同源單鏈區(qū)退火形成局部的雙鏈，在重組體系中含有的PfuDNA聚合酶的作用下，50 ℃、50 min的保溫可以使PfuDNA聚合酶以互補(bǔ)區(qū)域存在的兩個(gè)3′端為起始點(diǎn)，催化兩個(gè)片段同源重組互補(bǔ)區(qū)長(zhǎng)度的增加，使后續(xù)轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)同源雙鏈區(qū)更加穩(wěn)定，更有利于轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后進(jìn)行缺刻質(zhì)粒的修復(fù)。本研究結(jié)果證明促進(jìn)同源臂穩(wěn)定的匹配是提高重組效率的有效途徑。在同源臂僅為8 bp的條件下進(jìn)行重組反應(yīng)，降低后續(xù)同源臂延伸的溫度可以有效地提高克隆的效率，其主要原因是在50 ℃條件下延伸時(shí)，8 bp的同源區(qū)相互匹配的效率較低，造成同源臂的有效延伸下降，在保障充分的延伸時(shí)間條件下，降低延伸溫度可以提升同源臂延伸的有效性。感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率是影響體外重組克隆的重要因素。本研究利用實(shí)驗(yàn)室自制的轉(zhuǎn)化效率僅為2.2×106CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞即可實(shí)現(xiàn)高效的克隆，充分說明本研究體系的有效性。利用商業(yè)化的轉(zhuǎn)化效率為1.0×108CFU/μg的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行重組轉(zhuǎn)化，其形成的有效克隆數(shù)增加5–13倍 (以同源臂長(zhǎng)度為21、17、13 bp的1 kbnramp3基因?yàn)椴迦肫?，每微克載體形成的平均克隆數(shù)分別為127 842、75 233、51 036)；另外研究中也嘗試?yán)肊xo Ⅷ介導(dǎo)體外DNA重組克隆體系進(jìn)行多種類型 載體和不同基因的克隆，均顯示出高效性 (結(jié)果未顯示)。

本研究首次報(bào)道和應(yīng)用Exo Ⅷ于體外的DNA重組克隆體系，具有簡(jiǎn)便高效的顯著特征。