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        L-苯丙氨酸對蘋果醋發(fā)酵乙酸-2-苯乙酯合成途徑的影響

        2019-06-11 07:41:12張霽紅康三江張海燕曾朝珍黃玉龍
        中國釀造 2019年5期
        關(guān)鍵詞:蘋果醋苯丙氨酸酯酶

        宋 娟,張霽紅,康三江*,張海燕,曾朝珍,袁 晶,張 芳,黃玉龍

        (甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所,甘肅 蘭州 730070)

        蘋果醋是以蘋果汁或渣作為原料,經(jīng)過酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵后獲得[1],再加以調(diào)制成有獨特蘋果香氣的醋飲料[2-3]。由于蘋果品種差異、菌種老化、加工工藝單一等原因,導(dǎo)致追求蘋果醋制品多樣化的同時,卻引起果醋香氣等品質(zhì)的下降。

        L-苯丙氨酸是一種符合現(xiàn)代食品工業(yè)綠色安全標(biāo)準(zhǔn)的食品添加劑[4-5],主要是微生物通過從頭合成途徑和艾氏途徑將L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為β-苯乙醇[6]。許多發(fā)酵產(chǎn)品在發(fā)酵過程中由微生物自然形成具有風(fēng)味和香氣的酯類化合物,大多數(shù)酵母菌能產(chǎn)生雜醇油,而β-苯乙醇是雜醇油的重要組成部分,具有玫瑰香味;乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)是醋酸發(fā)酵的關(guān)鍵酶,該酶是膜結(jié)合蛋白,與醋酸菌的膜結(jié)合影響醋酸菌的乙醇轉(zhuǎn)化率和醋酸菌的產(chǎn)酸率[7];乙酸-2-苯乙酯是酵母菌發(fā)酵產(chǎn)品的主要的特征性香氣成分,具有甜蜜香味[8-9],已有研究發(fā)現(xiàn)其合成途徑有兩條[10-12]:(1)在酯酶(esterase)的作用下由乙酸和β-苯乙醇合成;(2)在醇?;D(zhuǎn)移酶(alcohl acyltransferaes,AAT)的作用下由乙酰輔酶A和β-苯乙醇形成。目前,國內(nèi)外學(xué)者主要采用不同處理方式如超聲[13]、微波[14],調(diào)控氮源濃度[15],不同特性的酵母菌種共發(fā)酵[16],生物酶解技術(shù)[17]等方法提高乙酸苯乙酯等酯類物質(zhì)的含量。在紅曲黃酒釀造中發(fā)現(xiàn)乙酸-2-苯乙酯是在后續(xù)發(fā)酵過程中酵母通過酯合成[18],主要是酯酶合成途徑[19];蘋果酒酵母代謝中乙酸苯乙酯主要由AAT催化合成[10],且AAT對乙酸苯乙酯的合成具有特異性[20],STRIBNY J等[21]也同樣提出葡萄酒釀造中AAT具有底物特異性。然而,在蘋果醋發(fā)酵過程中,L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯及其關(guān)鍵酶活的影響還未見相關(guān)研究。

        本試驗在該課題前期研究[22-23]的基礎(chǔ)上,采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(headspace solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry,HSSPME-GC-MS)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),初步分析食品添加劑L-苯丙氨酸對蘋果醋中合成乙酸-2-苯乙酯及其相關(guān)基質(zhì)和關(guān)鍵酶活的影響,為蘋果醋制品香氣成分和風(fēng)味物質(zhì)的代謝調(diào)控提供一定的參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        1.1.1 材料

        蘋果(“長富二號”紅富士):甘肅慶陽。

        釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC1750、巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)CICC20056:中國工業(yè)微生物菌種中心。

        1.1.2 培養(yǎng)基[24]

        基礎(chǔ)培養(yǎng)基:10 g/L葡萄糖,10 g/L酵母粉,pH 4.5。

        酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)培養(yǎng)基:20 g/L葡萄糖,20 g/L蛋白胨,10 g/L酵母粉。

        轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:60g/L葡萄糖,6g/L蛋白胨,0.5g/LMgSO4,5 g/LKH2PO4,分別添加0、2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L的L-苯丙氨酸,自然pH值。上述培養(yǎng)基滅菌條件均為121℃滅菌20 min。

        1.1.3 化學(xué)試劑

        氫氧化鈉(粒)、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、瓊脂、無水乙醇、碳酸鈣、MgSO4、KH2PO4(均為分析純及生化試劑):北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;果膠酶(>50 000 U/g):上海源聚生物科技有限公司;乙酸、乙醇、β-苯乙醇、乙酸-2-苯乙酯(色譜純):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;3-辛醇(色譜純)(67.396 mg/L):美國Sigma公司;L-苯丙氨酸(98.5%):上海生工生物公司股份有限公司;乙酰輔酶A/ADH/AAT/Esterase ELISA試劑盒:北京冬歌生物科技有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        BSA224S-CW電子天平:上海賽多利斯貿(mào)易有限公司;YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋:上海博迅實業(yè)有限公司;ZHJH-C1112B超凈工作臺:上海智城分析儀器制造有限公司;PZJ-0.5型榨汁機:江蘇科威機械有限公司;LRH-250生化培養(yǎng)箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;TRACE 1310-ISQ-LT氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀:美國賽默飛世爾科技有限公司;Synergy H1酶標(biāo)儀:美國伯騰儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 菌種活化

        吸取0.5 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解菌粉,菌懸液轉(zhuǎn)移至盛有5 mL液體培養(yǎng)基的試管中,24℃(CICC1750)/28℃(CICC 20056)恒溫培養(yǎng);劃線制備活化的酵母菌,按8%接種于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基,120 r/min、24 ℃培養(yǎng)48 h,備用。

        1.3.2 蘋果醋加工工藝流程

        富士蘋果→挑選、清洗、榨汁→蘋果汁、渣分離→果膠酶處理蘋果汁→接種酵母菌液(酒精發(fā)酵)→接種醋酸菌(醋酸發(fā)酵)→陳釀→蘋果醋

        操作要點:采用0.8%果膠酶(酶活>50000U/g)處理蘋果汁(降低果汁黏稠度,提高出汁率和澄清度);接種8%CICC1750酵母菌液,24℃條件下酒精發(fā)酵,當(dāng)酒精體積分?jǐn)?shù)不增加、糖度不降低時結(jié)束酒精發(fā)酵;接種10%CICC20056醋酸菌液,28℃條件下醋酸發(fā)酵,當(dāng)醋酸濃度不再升高時結(jié)束醋酸發(fā)酵。將醋酸發(fā)酵后的蘋果醋放入密閉容器中,控制溫度在18~25℃之間,靜置3個月以上完成陳釀過程。

        1.3.3 測定方法

        (1)揮發(fā)性物質(zhì)的測定[25-26]

        頂空固相微萃取法:樣品前處理采用SPME法處理,分別取5 mL樣品加入50 μL 3-辛醇內(nèi)標(biāo),漩渦混勻,裝入15 mL頂空瓶中,樣品由TriPlus RSH Autosampler-SPME系統(tǒng)處理,萃取頭:50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭。萃取條件:60.0℃吸附40 min。保溫5 min。外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品母液1 000 mg/L,100 mL純乙醇+0.1 g外標(biāo)(乙酸、β-苯乙醇、乙酸-2-苯乙酯),外標(biāo)測試樣品準(zhǔn)備A液10 mL(體積分?jǐn)?shù)4%乙醇溶液)+10 μL待測母液,樣品瓶5 mL+50 μL 3-辛醇內(nèi)標(biāo)。

        氣相色譜(GC)條件:進樣口溫度25℃,載氣氦氣(He),流速1.2 mL/min。進樣量1 μL,分流進樣,分流比40∶1。色譜柱為DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm),升溫程序40 ℃恒溫2min,以5℃/min升至180℃,然后從15℃/min升至230℃,5 min。

        質(zhì)譜(MS)條件:電子電離(electronic ionization,EI)源,電子能量70 eV,離子源溫度200℃,接口溫度250℃。掃描范圍33.00~350.00 u。

        (2)乙酰輔酶A、ADH、AAT、Esterase酶活性的測定[27]

        采用ELISA試劑盒檢測樣品中的乙酰輔酶A、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)、AAT、酯酶活性。酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔的OD450nm值,計算樣品濃度。

        (3)酒精度[28]:以乙醇計,GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》,密度瓶法測定。

        1.3.4 感官評價[29]

        以不同添加量L-苯丙氨酸處理的蘋果醋為基礎(chǔ)原料,加入蔗糖、蛋白糖、濃縮蘋果汁等,調(diào)配成蘋果醋飲料,經(jīng)過均質(zhì)、預(yù)熱、灌裝、密封,在95℃下保持10 min滅菌處理,冷卻得到成品,組織30名品評人員,按表1的內(nèi)容分別從色澤、香氣、滋味和組織形態(tài)共四個方面進行評定并打分(滿分100分計)。

        表1 蘋果醋飲料制品的感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of apple vinegar beverages

        1.3.5 數(shù)據(jù)處理

        采用Microsoft Excel 2010、SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析、采用Origin 8.5軟件作圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 L-苯丙氨酸對乙酸-2-苯乙酯合成途徑的影響

        2.2.1 L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯相關(guān)基質(zhì)濃度的影響

        L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯及其相關(guān)基質(zhì)濃度的影響結(jié)果見圖1。由圖1可以看出,隨著L-苯丙氨酸添加量的增加,β-苯乙醇、乙酸、乙酰輔酶A和乙酸-2-苯乙酯生成量均比對照樣(不添加L-苯丙氨酸)的高,說明L-苯丙氨酸有明顯的誘導(dǎo)乙酸-2-苯乙酯合成及其相關(guān)基質(zhì)生成量積累的作用,具有劑量依賴性。和對照樣相比,當(dāng)L-苯丙氨酸添加量為8 g/L時,β-苯乙醇、乙酸、乙酰輔酶A、乙酸-2-苯乙酯的濃度均達到最大值,分別增加了19.2%、35.9%、10.86%、51.6%。當(dāng)L-苯丙氨酸添加量>8g/L時,合成乙酸-2-苯乙酯及其相關(guān)基質(zhì)生成量都出現(xiàn)下降的現(xiàn)象,可能是發(fā)酵過程中代謝物的高濃度蓄積,存在產(chǎn)物抑制效應(yīng),抑制了微生物生長,導(dǎo)致發(fā)酵代謝物產(chǎn)量下降。因此,初步將8 g/L作為L-苯丙氨酸的最佳添加濃度。該添加量條件下更有利于增加蘋果醋發(fā)酵中特征性香氣成分乙酸-2-苯乙酯的生物合成,對合成乙酸-2-苯乙酯的醇?;D(zhuǎn)移酶途徑和酯酶途徑均有一定的影響。

        大多數(shù)研究表明,L-苯丙氨酸質(zhì)量濃度為5~10 g/L時為最佳底物濃度范圍[30],8 g/L L-苯丙氨酸最佳添加量,對β-苯乙醇轉(zhuǎn)化量的影響與牛明福等[24]的研究結(jié)果是一致的,而其對乙酸、乙酰輔酶A和乙酸-2-苯乙酯生成量的影響還未見相關(guān)報道。

        圖1 L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯及其相關(guān)基質(zhì)濃度的影響Fig.1 Effect of L-phenylalanine on the synthesis of acetic acid-2-phenyl ethyl ester and its related matrix concentration

        2.2.2 L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯關(guān)鍵酶活性的影響

        L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯關(guān)鍵酶活性的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知,和對照樣(不添加L-苯丙氨酸)相比,隨著L-苯丙氨酸添加量的增加,ADH和AAT酶活性出現(xiàn)不同程度的增加,然而酯酶活性明顯降低。其中,隨著L-苯丙氨酸添加量的增加,蘋果醋發(fā)酵液的ADH酶活均比對照樣的高,說明L-苯丙氨酸對ADH酶活有明顯誘導(dǎo)作用,可以誘導(dǎo)酒精發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇轉(zhuǎn)化為醋酸,L-苯丙氨酸添加量為8 g/L時,ADH酶活達到最大值,比對照樣提高30.98%(P<0.05);和對照樣相比,L-苯丙氨酸添加量為8 g/L時,AAT酶活達到最大值,而低濃度的L-苯丙氨酸對AAT酶活沒有明顯的誘導(dǎo)效果。因此,8 g/L的L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯關(guān)鍵酶ADH、AAT的酶活性均有一定的促進作用,推測L-苯丙氨酸添加量為8 g/L時,可以通過醇?;D(zhuǎn)移酶途徑促進乙酸-2-苯乙酯的合成,這與8 g/L的L-苯丙氨酸使得合成乙酸-2-苯乙酯及其相關(guān)基質(zhì)(β-苯乙醇、乙酸、乙酰輔酶A)生成量的達到最大值的數(shù)據(jù)結(jié)果一致。但是,不同濃度的L-苯丙氨酸處理的蘋果醋發(fā)酵液中酯酶活均比對照樣的低(P<0.05),說明L-苯丙氨酸對蘋果醋發(fā)酵液的酯酶活卻有一定的抑制作用,由于酯酶是可逆酶,可能是酯酶代謝途徑太長,支路太多,L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯的酯酶途徑影響的機理有待深入研究。

        圖2 L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯關(guān)鍵酶活性的影響Fig.2 Effects of L-phenylalanine on key enzymes activities in the synthesis of acetic acid-2-phenyl ethyl ester

        2.3 蘋果醋飲料感官評價

        不同添加量L-苯丙氨酸處理的蘋果醋飲品的感官評價結(jié)果見表2。從表2的感官評價結(jié)果可以看出,對不同添加量L-苯丙氨酸處理的蘋果醋飲料制品屬于中上等級,其中8 g/L的L-苯丙氨酸處理的蘋果醋飲料感官評價最優(yōu),具有較濃厚的香氣和風(fēng)味。

        表2 不同添加量L-苯丙氨酸處理的蘋果醋飲料制品的感官評價Table 2 Sensory evaluation of apple vinegar beverages treated with different L-phenylalanine addition

        3 結(jié)論

        在蘋果醋發(fā)酵過程中,初步發(fā)現(xiàn)食品添加劑L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯及其相關(guān)基質(zhì)的生成量和關(guān)鍵酶活性有一定的影響。當(dāng)L-苯丙氨酸添加量為8 g/L時,β-苯乙醇、乙酸、乙酰輔酶A、乙酸-2-苯乙酯的質(zhì)量濃度分別提高了19.2%、35.9%、10.86%、51.6%,且不同添加量的L-苯丙氨酸有明顯誘導(dǎo)乙酸-2-苯乙酯合成及其相關(guān)基質(zhì)生成量積累的作用,具有劑量依賴性;同時,L-苯丙氨酸可以誘導(dǎo)ADH將乙醇轉(zhuǎn)化為醋酸、催化β-苯乙醇和乙酰輔酶A通過醇?;D(zhuǎn)移酶途徑生成乙酸-2-苯乙酯,卻對酯酶活性有抑制作用,不利于乙酸-2-苯乙酯通過酯酶途徑進行生物合成。綜合考慮,初步推測將8 g/L作為L-苯丙氨酸的最佳添加量,通過醇?;D(zhuǎn)移酶途徑促進乙酸-2-苯乙酯的合成及其相關(guān)基質(zhì)(β-苯乙醇、乙酸、乙酰輔酶A)的生成量和關(guān)鍵酶ADH、AAT的酶活性,經(jīng)感官評價得出8 g/L L-苯丙氨酸處理的蘋果醋飲料制品能較好的滿足消費者的需求,為高品質(zhì)蘋果醋的技術(shù)研究和指導(dǎo)生產(chǎn)實踐提供一定的理論依據(jù)。

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