唐婧紅，陳 雪*，代園鳳，李 祝，楊佩斯，張 素，吉玉玉，張欽語，趙妗頤

（1.貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025）

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起的一種維管束細菌性土傳細菌性病害[1-2]，最典型的癥狀是枯萎。發(fā)病初期往往出現(xiàn)煙株一側葉片枯萎，另一側葉片正常。枯萎一側莖上有黑色條斑，根系變黑腐爛。發(fā)病后期，整株枯死[3]，是制約煙草生產的主要病害[4]。

煙草青枯病的防治方法有農業(yè)防治、選育和栽培高抗品種、化學防治、生物防治等[5]。在我國，煙草青枯病的防治方法主要是化學防治，但是化學藥物的長期使用不僅使病原菌產生抗藥性而且會引起土壤、水體污染等[6]。因此，生物防治顯得尤為重要[7]。近些年對于土傳病害主要研究領域是利用植物根際促生細菌[8-9]和內生細菌[10]等方法來防治。據(jù)文獻報道的防治煙草青枯病的拮抗細菌有芽孢桿菌（如枯草芽孢桿菌、短芽孢桿菌[11]、多粘類芽孢桿菌等）、假單胞菌（如銅綠假單胞菌[12]、熒光假單胞菌等）、放線菌（如灰白鏈霉菌、檸檬熒光鏈霉菌、極美鏈霉菌）等[13]。由于拮抗細菌容易受環(huán)境影響，所以局限于盆栽或小區(qū)試驗，進入實際生產的很少[14-15]。目前，對于防治植物青枯病的真菌鮮有報道，主要停留在叢枝菌根真菌和煙曲霉方面[16]。劉先良等[17]發(fā)現(xiàn)，叢枝菌根真菌可促進煙草植株生長，煙株地上部和根系的干質量和磷含量以及地上部的氮含量顯著增加，同時煙草青枯病的病情指數(shù)及發(fā)病率降低。周曉見等[18-19]從煙田分離出一株對青枯雷爾氏菌有穩(wěn)定拮抗效果的真菌，鑒定為煙曲霉。

黑曲霉（Aspergillusniger）作為美國食品藥品監(jiān)督管理局認定的安全發(fā)酵菌種，其適宜在酸性環(huán)境下生長繁殖，菌體及發(fā)酵產物對人畜無害，不影響環(huán)境[20]。目前，有報道利用黑曲霉孢子粉粗提物對青枯雷爾氏菌、根癌農桿菌植物病菌進行抑菌試驗[21]和一種黑曲霉微丸對魔芋白絹病和軟腐病進行防治[22]。黑曲霉泡騰片是一種新型的生防菌劑，它具有在水中快速崩解、攜帶方便、省時省力等特點[23]。本試驗研究了黑曲霉泡騰片對煙草青枯病的防治效果和對煙草農藝性狀的影響，以期為生防菌在煙草田間的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

煙草青枯雷爾氏病菌（Ralstoniasolanacearum）CQ11-2：分離自貴州省畢節(jié)地區(qū)大方縣煙草青枯病株，保存于貴州大學生命科學學院微生物實驗室。黑曲霉（Aspergillusniger xj）：由貴州大學真菌資源研究所分離，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學），保藏號：CCTCCNO：M206021。

二甲基亞砜（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；氯霉素（分析純）：北京索寶來科技有限公司；氯化鈉（分析純）：重慶川東化工集團有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均為生化試劑）：上海盛思生化科技有限公司。

1.1.2 供試煙草品種

煙草品種云煙87：由貴州省煙草公司畢節(jié)市公司田壩鎮(zhèn)煙草基地提供。

1.2 儀器與設備

BIOMATE 3S紫外分光光度計：賽默飛世爾科技有限公司；HPD-68A恒溫搖床：常州市華普達教學儀器有限公司；SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

將青枯雷爾氏病菌接種在牛肉膏蛋白胨斜面上于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用無菌水沖洗斜面并稀釋成1×108CFU/mL，備用。

1.3.2 黑曲霉泡騰片抑菌試驗

將黑曲霉孢子粉泡騰片、泡騰片輔料溶于二甲基亞砜，配制成質量濃度為500 mg/mL的溶液。在無菌條件下，分別向1 mL的液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入10 μL上述溶液，使培養(yǎng)體系終質量濃度為5 mg/mL。按20%的接種量接入菌懸液，以二甲基亞砜為溶劑對照、氯霉素為藥物對照。每個處理組3個平行實驗，在37℃、150 r/min的條件下進行搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h，最大吸收波長420 nm處測定其OD420nm值，進而計算其抑菌率。抑菌率計算公式為：

1.3.3 育苗試驗

黑曲霉泡騰片生防菌劑對煙苗生長試驗于2018年2月28日至4月20日在畢節(jié)市七星關區(qū)田壩鎮(zhèn)試驗苗棚進行。參照黑曲霉泡騰片制備工藝優(yōu)化的方法[23]，制備黑曲霉泡騰片。將黑曲霉泡騰片與水按1∶1 000（g∶mL）的比例投入育苗池中，將育苗盤置于帶水的育苗池內，以清水培育的煙苗作對照，煙苗移栽前隨機抽取10株煙苗，測量并記錄其葉片數(shù)、株高、根長、鮮質量、干質量、最大葉長、葉寬。

1.3.4 盆栽試驗

選取長勢一致的煙苗（4片真葉）移栽至盆中。分成6組，每組4個重復。移栽后分別澆灌清水、稀釋800倍、1 000倍、1 200倍的泡騰片和稀釋800倍、1 000倍和1 200倍的多粘類芽孢桿菌的定根水，一天一次，一次50 mL，一周后全部統(tǒng)一澆清水，煙草長至6～8葉，備用。

（1）農藝性狀

參照行業(yè)標準YC/T 142—2010《煙草農藝性狀調查方法》調查其葉片數(shù)、株高、最大葉長、葉寬等農藝性狀。

（2）病情調查

注射器抽取30 μL濃度為108CFU/mL的菌懸液，用針頭在葉片主脈兩側不完全對稱的位置上各刺2～3下，取下針頭，用注射器注孔抵壓住已刺孔部位，將菌懸液注射至上下表皮之間。每處理接種3片葉，重復4次，清水作對照，每天觀察記載葉片注射區(qū)癥狀的變化。10 d后以葉片為單位進行病情分級[24]，分級標準見表1[25]。

表1 葉片病情分級標準Table 1 Grading standards of leaf disease

病情指數(shù)和防治效果計算公式如下：

1.3.5 大田試驗

大田試驗在貴州省畢節(jié)市七星關區(qū)田壩鎮(zhèn)煙草試驗基地進行。分別設2個處理，即稀釋1 000倍黑曲霉泡騰片和清水（對照）作定根水，每個處理3個重復區(qū)組，每區(qū)組60株煙株，行距1.2 m，株距0.5 m，隨機區(qū)組排列。參照行業(yè)標準YC/T 142—2010《煙草農藝性狀調查方法》[26]，采用5點法取樣，每點調查5株，分別在團棵期、旺長期調查煙草株高、葉片數(shù)、莖圍和最大葉長、葉寬等主要農藝性狀。

1.3.6 分析測定

抽取對照與施用黑曲霉泡騰片的初烤煙葉中部混合樣品，送至貴州省煙草科學研究院分析檢測研究中心進行感官質量檢測，貴州省煙草科學研究院評煙委員會進行評吸，感官評吸標準見表2[27]。

表2 煙葉感官評吸標準Table 2 Smoking sensory evaluation standard of tobacco leaf

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 黑曲霉泡騰片抑菌效果

黑曲霉泡騰片、輔料、二甲基亞砜、氯霉素對青枯雷爾氏菌的抑菌效果表明，黑曲霉泡騰片與氯霉素對青枯雷爾氏菌有較好的抑制作用，抑菌率達分別82.88%和93.23%，而輔料和二甲基亞砜對青枯雷爾氏菌無抑菌作用。為后續(xù)的防治煙草青枯病提供了良好的依據(jù)。

2.2 黑曲霉泡騰片對煙草育苗的影響

黑曲霉泡騰片對煙草育苗的影響結果見表3。

由表3可以看出施用黑曲霉泡騰片的煙草的農藝性狀優(yōu)于對照組。其中葉片數(shù)、葉長、葉寬、株高、鮮質量、干質量較對照分別增加了6.70%、42.09%、29.28%、9.42%、105.16%、70.07%。葉長、葉寬和鮮質量與對照間差異顯著（P＜0.05）。

表3 黑曲霉泡騰片對煙草育苗的影響Table 3 Effect of Aspergillus niger effervescent tablets on tobacco seedling growth

2.3 黑曲霉泡騰片對煙草盆栽生長的影響

2.3.1 不同稀釋倍數(shù)泡騰片與多粘類芽孢桿菌對煙草生長的影響

將黑曲霉泡騰片分別稀釋800倍、1 000倍、1 200倍，多粘類芽孢桿菌稀釋1 000倍、1 200倍為生物對照藥，清水為對照，測量其葉片數(shù)、葉長、葉寬、直徑和株高，結果見表4。

表4 不同稀釋倍數(shù)對煙草生長的影響Table 4 Effect of different dilution times on tobacco growth

由表4可知，黑曲霉泡騰片稀釋800倍的處理組的農藝性狀優(yōu)于清水對照和其他濃度處理，多粘類芽孢桿菌稀釋1 200倍（除株高）的農藝性狀優(yōu)于同種藥物的其他稀釋倍數(shù)的農藝性狀。通過方差分析，不同處理均與對照間差異顯著（P＜0.05）。其中黑曲霉泡騰片施用效果最佳為稀釋800倍，株高比對照增加80%，葉長比對照增加37.8%、葉寬比對照增加40.37%、直徑比對照增加25%、葉片數(shù)比對照增加60%。而多粘類芽孢桿菌處理組中，稀釋1 200倍效果最佳，株高比對照增加37.8%、葉長比對照增加23.8%、葉寬比對照增加15.12%、直徑比對照增加25%、葉片數(shù)比對照增加55%。綜上，施用稀釋800倍黑曲霉泡騰片的煙株農藝性狀最優(yōu)。

2.3.2 不同稀釋倍數(shù)對煙草青枯病的防治效果

不同稀釋倍數(shù)對煙草青枯病的防治結果見表5，通過盆栽試驗，結果表明，黑曲霉泡騰片稀釋1200倍和稀釋1000倍，相對防效為71.4%，優(yōu)于生防農藥多粘類芽孢桿菌稀釋1200倍的防效（42.9%），當泡騰片稀釋800倍，相對防效高達92.9%。由此可見，黑曲霉泡騰片的防治效果突出?？紤]到成本問題，在進行大田試驗時，發(fā)病嚴重的地塊，采用800倍稀釋的藥劑進行預防，而發(fā)病較輕的地塊采用1 000倍稀釋的藥劑進行預防。

表5 黑曲霉泡騰片對煙草青枯病溫室防效Table 5 Effect of Aspergillus niger effervescent tablets on greenhouse control of tobacco bacterial wilt

2.4 大田試驗結果

采用1 000倍稀釋的藥劑進行預防，不同處理組煙葉的農藝性狀見表6。

表6 不同處理各生育期農藝性狀Table 6 Agronomic traits at different growth stages under different treatments

由表6可知，黑曲霉泡騰片處理煙葉團棵期和旺長期的農藝性狀都優(yōu)于對照組，其中團棵期的葉片數(shù)比對照增加47.3%、葉長比對照增加38.21%、葉寬比對照增加65.31%、直徑比對照增加84.21%、株高比對照增加58.98%，葉片數(shù)、葉長、葉寬、直徑和株高與對照間存在顯著差異（P＜0.05）。旺長期的葉片數(shù)比對照增加58.98%、葉長比對照增加8.62%、葉寬比對照增加19.24%、直徑比對照增加28.9%、株高比對照增加5.31%。葉片數(shù)、葉長、葉寬、直徑與對照間有顯著差異（P＜0.05）；株高與對照間沒有顯著差異（P＞0.05）。總的來說，1000倍稀釋的黑曲霉泡騰片在團棵期和旺長期對煙草有明顯的促生效果。由于田間對照和施用黑曲霉泡騰片的田塊都未發(fā)生煙草青枯病，所以沒有采集到大田防效的數(shù)據(jù)。

2.5 煙葉評吸質量

黑曲霉泡騰片處理的煙葉的感官評吸結果見表7。由表7可知，施用黑曲霉泡騰片的煙葉評吸結果均優(yōu)于對照。說明施用黑曲霉泡騰能改善煙葉香氣質，增加煙葉香氣量，使余味更加舒適，減輕煙葉的雜氣和刺激性，提高煙葉的可用性。

表7 煙葉評吸結果Table 7 Smoking evaluation results of tobacco leaf

3 結論

本試驗以云煙87為試材，通過盆栽試驗和大田試驗對黑曲霉泡騰片的生防效果和促生效果進行探究。盆栽試驗表明，黑曲霉泡騰片稀釋800倍時，對煙草青枯病的防治效果可達92.9%，顯著高于多粘類芽孢桿菌（42.9%）的防效，且有良好的促生效果。對采集的團棵期、旺長期煙株農藝性狀的大田數(shù)據(jù)進行分析，結果表明，黑曲霉泡騰片對煙株的生長有明顯的促進作用，而且可以改善煙葉香氣質，增加煙葉香氣量，使余味更加舒適，減輕煙葉的雜氣和刺激性，提高煙葉的可用性。黑曲霉作為美國食品及藥物管理局認定的安全發(fā)酵菌種，因而具有很強的應用潛力，但是關于黑曲霉泡騰片的促生機理、定殖能力和對煙草的經(jīng)濟性狀的影響還需進一步的研究。