余騰驊，涂剛，彭美茜，孫可馨，柳滿然

（1.江西省腫瘤醫(yī)院 乳腺腫瘤外科，江西 南昌 330029；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌乳腺外科，重慶400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016）

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）旁分泌多種生長因子、蛋白水解酶等促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及多種臨床藥物耐受[1-4]。值得注意的是，乳腺癌微環(huán)境中約80%的正常成纖維細(xì)胞被激活為CAFs，是腫瘤組織中最主要的成分之一[5]。G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）被公認(rèn)為第三種獨(dú)立作用的雌激素受體，在多種正常細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞系中均證實(shí)17-β雌二醇（E2）及GPER特異性激動(dòng)劑G1均可活化GPER并介導(dǎo)下游雌激素效應(yīng)[6-13]，是預(yù)測乳腺癌患者臨床預(yù)后、內(nèi)分泌治療獲得性耐藥及靶向治療的有效生物學(xué)指標(biāo)。研究團(tuán)隊(duì)在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GPER介導(dǎo)CAFs中芳香化酶基因CYP19A1與糖酵解基因PDK4高轉(zhuǎn)錄活性，可能是促進(jìn)腫瘤組織中局部雌激素水平增加與酸性微環(huán)境的關(guān)鍵因素，從而在乳腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及藥物耐受中扮演始動(dòng)作用[11-13]，GPER或是介導(dǎo)CAFs與腫瘤細(xì)胞之間“交叉對(duì)話”進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展的重要媒介。

成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs）是一類能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化的多肽家族，在機(jī)體許多組織和器官內(nèi)均有不同程度的分布?，F(xiàn)有研究[14-16]表明，成纖維細(xì)胞生長因子2（FGF2）的過量表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，不僅參與腫瘤血管新生，還間接調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長及侵襲轉(zhuǎn)移能力。然而，乳腺癌微環(huán)境CAFs中GPER介導(dǎo)的生長因子調(diào)節(jié)作用研究較少，其與FGF2的調(diào)控關(guān)系及下游生物學(xué)作用更是研究“盲點(diǎn)”。因此，本研究擬利用E2、G1及FGF2中和抗體[17]等小分子化合物首次探討共培養(yǎng)條件下乳腺癌微環(huán)境CAFs中細(xì)胞漿GPER活化對(duì)FGF2的表達(dá)調(diào)控作用及其旁分泌對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

MCF-7細(xì)胞系（ER+）和MDA-MB-468細(xì)胞系（ER-）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，研究團(tuán)隊(duì)前期已構(gòu)建體外穩(wěn)定培養(yǎng)的永生化CAFs細(xì)胞株[11-13]，高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），南美胎牛血清（Gibco公司)。E2與GPER特異性激動(dòng)劑G1（Sigma公司），F(xiàn)GF2中和抗體（Millipore公司），DAPI與FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（北京中杉金橋公司），F(xiàn)GF2 ELISA試劑盒（Rapidbio公司），總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），熒光定量PCR試劑盒（BioTeKe公司），GPER抗體（Abcam公司），CCK-8試劑盒（碧云天公司）。流式細(xì)胞儀（FACS Callur），CO2培養(yǎng)箱（Thermo scientific），多功能酶標(biāo)儀（Sunrise），MiniOpticon實(shí)時(shí)PCR儀和穩(wěn)壓DNA電泳儀（BioRad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)MCF-7、MDA-MB-468 及 CAFs細(xì)胞均培養(yǎng)于10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)生長，隔日換液，待細(xì)胞密度生長至90%左右時(shí)用0.25%胰酶消化離心后傳代。

1.2.2 乳腺腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基的獲取乳腺癌MCF-7與MDA-MB-468細(xì)胞生長于10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度生長至約70%～80%，將培養(yǎng)液更換為1% FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30 h后，將培養(yǎng)基收集后離心，其上清液即為腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM）[13]。

1.2.3 CAFs與乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)模型根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選取以下方式：⑴收集腫瘤細(xì)胞CM處理CAFs細(xì)胞 36 h；⑵Transwell小室法共培養(yǎng) 24 h，CAFs細(xì)胞種于上室，腫瘤細(xì)胞種于下室，細(xì)胞比例為3:1。分別得到CAFs+MCF-7與CAFs+MDAMB-468共培養(yǎng)細(xì)胞模型[13]。

1.2.4 GPER核輸出信號(hào)（NES）序列突變依托上海吉碼制藥技術(shù)有限公司對(duì)GPER NES序列：YFINLAVADLILV的核心區(qū)域LIL進(jìn)行突變，得到突變型YFINLAVADAAAV的質(zhì)粒，課題組已在前期研究中用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染等方法獲得穩(wěn)定篩選的GPER NES序列突變型細(xì)胞株CAFs（M）[13]。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光檢測CAFs細(xì)胞中GPER表達(dá)定位取單獨(dú)培養(yǎng)及共培養(yǎng)條件下對(duì)數(shù)期生長的野生型CAFs與突變型CAFs（M）細(xì)胞胰酶消化離心重懸后以2×105/mL接種于底部放有小玻片的24孔板中，置于細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長狀態(tài)及密度合適后，取出24孔板用PBS洗3次，加入4%多聚甲醛200 μL固定20min，PBS洗3次，10%山羊血清37℃封閉30 min，加入GPER抗體（1:100稀釋）30～40 μL，4℃孵育過夜，PBS洗3次，暗室中加入FITC熒光二抗（1:200），37℃60min，PBS洗3次，加入DAPI（1:10）染核5min，PBS洗3次，每次 5 min，封片后，倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.2.6 熒光定量PCR檢測CAFs細(xì)胞中FGF2 mRNA表達(dá)量CAFs細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)或取不同的共培養(yǎng)細(xì)胞模型，待CAFs細(xì)胞生長至70%～80%后，更換無血清培養(yǎng)基饑餓24 h。分別加入100 nmol/L E2與100 nmol/L G1 處理 CAFs細(xì)胞12 h（藥物處理濃度參考研究團(tuán)隊(duì)前期研究[13]），各組調(diào)整DMSO至一致，最后分別得到對(duì)照組、E2處理組、G1處理組，處理相應(yīng)時(shí)間后立即終止藥物處理，用TRIzol試劑提取各組CAFs細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)均按照TaKaRa試劑盒及熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行操作。FGF2上游引物序列為5'-AGC CAG GTA ACG GTT AGC AC-3'，下游引物序列為5'-GGA GAA GAG CGA CCC TCA C-3'；以 β-actin為內(nèi)參對(duì)照，上游引物序列為5'-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3'，下游引物序列為5'-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3'。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.2.7 ELISA 法檢測 CAFs細(xì)胞上清中 FGF2的分泌量實(shí)驗(yàn)分組同1.2.6，待CAFs細(xì)胞生長至80%～90%后，更換無血清培養(yǎng)基饑餓24 h。分別加入100nmol/LE2與100nmol/LG1處理CAFs細(xì)胞24 h，各組調(diào)整DMSO至一致，最后分別得到對(duì)照組、E2處理組、G1處理組，處理相應(yīng)時(shí)間后立即終止藥物處理，收集細(xì)胞上清液，保存于-80℃冰箱，按ELISA試劑盒操作說明書檢測各組樣本中FGF2的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測乳腺癌細(xì)胞周期取對(duì)數(shù)生長期MCF-7、MDA-MB-468與CAFs細(xì)胞胰酶消化離心重懸后，接種于6孔板及Transwell小室中，用10%胎牛血清的無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至腫瘤細(xì)胞密度達(dá)到約50%，移去培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入無血清無酚紅DMEM培養(yǎng)基饑餓24 h，使各組細(xì)胞周期同步于G0/G1期。分別加入100 nmol/L E2、100 nmol/L G1與2 μg/mL FGF2中和抗體處理上室中CAFs細(xì)胞24 h，各組調(diào)整DMSO至一致，24 h后收獲下室中乳腺癌細(xì)胞，70%乙醇固定，置于4℃冰箱過夜，PI染色避光室溫孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞中各細(xì)胞周期中DNA的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 CCK8法檢測乳腺癌細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分組及方法同1.2.8，乳腺癌細(xì)胞與CAFs分別接種于96孔板及Transwell小室中，加入100 nmol/L E2、100nmol/LG1與2μg/mL FGF2中和抗體處理上室中CAFs細(xì)胞24 h，各組調(diào)整DMSO至一致，24 h后取出 Transwell小室，每孔加入10 μL CCK-8試劑，細(xì)胞孵箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度（OD值），波長選擇450 nm，獲得各組相對(duì)細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組間比較采用重復(fù)測量方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同類型乳腺癌細(xì)胞均可誘導(dǎo)CAFs中GPER發(fā)生細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明：CAFs細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)條件下，GPER主要表達(dá)于細(xì)胞核，而與ER+乳腺癌MCF-7及ER-乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞共培養(yǎng)后，CAFs中GPER的表達(dá)定位由細(xì)胞核轉(zhuǎn)位入細(xì)胞漿中；GPER NES序列突變后，上述兩種類型的乳腺癌細(xì)胞均不能使CAFs（M）中GPER發(fā)生核漿轉(zhuǎn)位，與前期結(jié)果一致[13]（圖1）。

圖1 免疫熒光法檢CAFs細(xì)胞中GPER的表達(dá)定位（綠色熒光代表目的蛋白GPER，藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核；×400）Figure 1 Determination of GPER expression localization in CAFs by immuno fl uorescence(green fl uorescence showing GPER,and blue fl uorescence showing the cell nucleus;×400)

2.2 共培養(yǎng)條件下，E2與G1上調(diào)CAFs細(xì)胞中FGF2的表達(dá)及分泌

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，共培養(yǎng)條件下，分別用E2和G1處理CAFs細(xì)胞12 h后，均可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)FGF2 mRNA表達(dá)水平，明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05）。ELISA結(jié)果進(jìn)一步顯示，藥物處理24 h后，E2及G1明顯促進(jìn)共培養(yǎng)模型CAFs細(xì)胞上清液中FGF2的分泌量（均P＜0.05）。而單獨(dú)培養(yǎng)條件下，則無上述現(xiàn)象（圖2）。

突變共培養(yǎng)模型CAFs中GPER NES序列后，E2與G1的上述作用被取消，與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）（圖3）。

圖2 熒光定量PCR及ELISA檢測CAFs中FGF2 mRNA表達(dá)及上清液中FGF2含量 1）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與CAFs+E2組比較，P＜0.05；3）與CAFs+G1組比較，P＜0.05Figure 2 Detection of FGF2 mRNA expression in CAFs and FGF2 level in culture supernatant by real-time qPCR and ELISA 1)P＜0.05vs.blank control;2)P＜0.05vs.CAFs alone+E2;3)P＜0.05vs.CAFs alone+G1

圖3 突變GPER NES序列對(duì)CAFs中FGF2 mRNA表達(dá)及上清液中FGF2含量的影響 1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與CAFs（M）+E2 組比較，P＜0.05；3）與CAFs（M）+G1 組比較，P＜0.05Figure 3 In fl uences of GPER NES sequence mutation on FGF2 mRNA expression in CAFs and FGF2 level in culture supernatant 1)P＜0.05vs.blank control;2)P＜0.05vs.CAFs(M)+E2;3)P＜0.05vs.CAFs(M)+G1

2.3 CAFs中細(xì)胞漿GPER介導(dǎo)的FGF2旁分泌促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞周期進(jìn)展

細(xì)胞周期結(jié)果顯示，分別用E2和G1處理共培養(yǎng)模型中CAFs細(xì)胞24 h后，兩種藥物均可降低乳腺癌MCF-7與MDA-MB-468細(xì)胞周期中靜止期（G0/G1期）細(xì)胞的比例，促進(jìn)細(xì)胞周期向增殖期（S期與G2/M期）進(jìn)展。其中E2及G1處理后腫瘤細(xì)胞處于S期的DNA改變量最為明顯（P＜0.05），其促細(xì)胞周期進(jìn)展的效應(yīng)被FGF2的特異性中和抗體所阻斷（圖4）。

2.4 CAFs中細(xì)胞漿GPER介導(dǎo)的FGF2旁分泌增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞增殖能力

CCK-8法檢測結(jié)果進(jìn)一步顯示，E2及G1處理CAFs細(xì)胞24 h后，可明顯促進(jìn)共培養(yǎng)模型中乳腺癌細(xì)胞增殖，且其促增殖效應(yīng)被FGF2中和抗體所拮抗（圖5）。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測共培養(yǎng)條件下乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期 1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與E2+FGF2中和抗體組比較，P＜0.05；3）與G1+FGF2中和抗體組比較，P＜0.05Figure 4 Detection of cell cycle of the breast cancer cells under co-culture condition by flow cytometry 1)P＜0.05vs.control;2)P＜0.05vs.E2+FGF2 neutralizing antibody;3)P＜0.05vs.G1+FGF2 neutralizing antibody

圖5 CCK-8法檢測共培養(yǎng)條件下乳腺癌細(xì)胞增殖情況1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與E2+FGF2中和抗體組比較，P＜0.05；3）與G1+FGF2中和抗體組比較，P＜0.05Figure 5 Determination of breast cancer cells proliferation under co-culture condition by CCK-81)P＜0.05 vs.control;2)P＜0.05vs.E2+FGF2 neutralizing antibody;3)P＜0.05vs.G1+FGF2 neutralizing antibody

3 討 論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅僅被認(rèn)為是腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞本身的單獨(dú)作用，其微環(huán)境成分也同時(shí)作為腫瘤的核心特征被廣泛接受[18-19]。研究團(tuán)隊(duì)前期體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示CAFs單獨(dú)培養(yǎng)條件下GPER主要表達(dá)于細(xì)胞核中，而這與免疫組化實(shí)驗(yàn)所觀察到GPER主要表達(dá)于腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞（tumor stromal fibroblasts，TSFs）中細(xì)胞漿的結(jié)果不相符合[13]。事實(shí)上，生理?xiàng)l件下CAFs可能受到腫瘤組織中多種成分的影響，而腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞與CAFs是乳腺腫瘤中最主要的兩大成分，因此提示在體內(nèi)環(huán)境乳腺癌細(xì)胞可能影響CAFs中GPER的細(xì)胞內(nèi)定位。僅僅單獨(dú)研究CAFs中GPER的生物學(xué)功能可能是不妥的，乳腺癌細(xì)胞與CAFs之間的“交叉對(duì)話”須考慮在內(nèi)，這更加符合實(shí)體腫瘤真實(shí)的“內(nèi)部環(huán)境”。本研究在不同類型的乳腺癌（ER+型MCF-7與ER-型MDA-MB-468）細(xì)胞中均證實(shí)了GPER的核漿轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，提示CAFs中GPER的核漿轉(zhuǎn)位可能是乳腺腫瘤的普遍特點(diǎn)之一，其在腫瘤進(jìn)展及藥物耐受中或發(fā)揮關(guān)鍵性作用，可能是潛在的治療靶點(diǎn)。

近年來，GPER所介導(dǎo)的腫瘤旁分泌效應(yīng)越來越被諸多研究者所關(guān)注。郭林英等[20]報(bào)道CAFs中GPER可介導(dǎo)細(xì)胞因子HMGB1外分泌促進(jìn)ER+乳腺癌細(xì)胞自噬。此外，在ER-乳腺癌細(xì)胞中，雌激素還可通過活化GPER自分泌炎癥因子IL-6進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞快速生長[21]。同樣，筆者在前期研究中也證實(shí)GPER創(chuàng)造乳酸微環(huán)境引起乳腺癌細(xì)胞能量代謝重塑從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的臨床多藥耐受[13]。本研究進(jìn)一步明確了乳腺癌微環(huán)境GPER與成纖維細(xì)胞因子家族成員FGF2的潛在調(diào)控關(guān)系：共培養(yǎng)條件下雌激素活化CAFs中細(xì)胞漿GPER促進(jìn)FGF2的表達(dá)及旁分泌，突變GPER的NES序列（GPER位于CAFs細(xì)胞核）后可阻斷上述效應(yīng)。同時(shí)，CAFs單獨(dú)培養(yǎng)條件下則未觀察到上述現(xiàn)象，更進(jìn)一步提示共培養(yǎng)下微環(huán)境GPER細(xì)胞漿定位的獨(dú)特生物學(xué)作用。然而，CAFs中雌激素/GPER/FGF2信號(hào)軸活化的具體機(jī)制尚不明確，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究。

現(xiàn)有研究表明，F(xiàn)GF2的過量表達(dá)及下游信號(hào)的過度活化參與腫瘤惡性臨床進(jìn)展[22-23]。在慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CML）中，F(xiàn)GF2表達(dá)異常升高將導(dǎo)致CML細(xì)胞對(duì)靶向藥物伊馬替尼治療不敏感[24]。Terai等[25]則證實(shí)非小細(xì)胞肺癌中FGF2及其受體FGFR1活性增強(qiáng)將引起腫瘤細(xì)胞快速增殖及轉(zhuǎn)移，且對(duì)靶向藥物吉非替尼出現(xiàn)耐藥。同樣，本研究也得到類似結(jié)果：微環(huán)境GPER所介導(dǎo)的FGF2旁分泌可顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞周期進(jìn)展及腫瘤快速生長，應(yīng)用FGF2的特異性中和抗體可明顯逆轉(zhuǎn)以上效應(yīng)，提示靶向阻斷CAFs中雌激素/GPER/FGF2信號(hào)通路可能是對(duì)抗腫瘤臨床進(jìn)展的新型治療模式，但這還需要更多的體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證與支持。