牛雪可， 邱文， 蘭永哲， 李文均， 廖萬(wàn)清， 沈志平， 余能彬， 鄒成剛， 康穎倩*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省微生物與人類健康關(guān)系研究人才基地暨貴州省普通高校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 3.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510275； 4.第二軍醫(yī)大學(xué) 上海長(zhǎng)征醫(yī)院 真菌學(xué)研究所， 上海 200003； 5.貴州正業(yè)國(guó)際工程企業(yè)管理集團(tuán)有限公司， 貴州 貴陽(yáng) 550000； 6.云南大學(xué) 云南生物資源保護(hù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南 昆明 650091)

陸地?zé)崛h(huán)境屬于地球上存在了數(shù)十億年的極端環(huán)境之一[1]，曾經(jīng)被認(rèn)為是無(wú)菌環(huán)境[2]，但是Thomas Brock[3]首次在黃石國(guó)家公園熱噴口發(fā)現(xiàn)Thermusaquaticus，徹底改變了人們對(duì)熱泉微生物的認(rèn)識(shí)。熱泉與地球早期的化學(xué)環(huán)境相似[4]，因此研究熱泉中的微生物群落和其結(jié)構(gòu)具有非常重要的研究意義和價(jià)值。從1986年至今，中國(guó)能源研究會(huì)地?zé)釋I(yè)委員會(huì)在中國(guó)發(fā)現(xiàn)了3 398個(gè)熱泉，主要集中于云南和西藏[5]，該地區(qū)的研究者們對(duì)熱泉中微生物的多樣性進(jìn)行了廣泛的研究[6-9]。近年的研究表明，干旱、溫度以及鹽度等環(huán)境變化，可導(dǎo)致微生物代謝及生存能力的明顯下降[10-11]。貴州位于中國(guó)西南部，蘊(yùn)藏著大量熱泉資源，本次研究樣本來(lái)自貴州某一新探測(cè)、但并未開發(fā)的熱泉。本研究對(duì)該高溫?zé)崛锌膳囵B(yǎng)微生物進(jìn)行了研究，并設(shè)置不同培養(yǎng)溫度來(lái)模擬環(huán)境變化，比較不同溫度下微生物多樣性的差異，為熱泉微生物資源的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，為研究溫度對(duì)熱泉微生物多樣性變化、進(jìn)化以及適應(yīng)機(jī)制的形成等理論問(wèn)題提供菌株資源及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品、材料和儀器

1.1.1樣品 2017年9月采集貴州省貴陽(yáng)市青巖古鎮(zhèn)某未開發(fā)熱泉(26°32′69″N，106°68′65″E),熱泉溫度90 ℃。將采集的熱泉水置于500 mL無(wú)菌藍(lán)蓋瓶中，4 ℃保存。

1.1.2分離培養(yǎng)基 R2A培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，胰蛋白胨0.5 g，酵母浸膏0.5 g，酸水解酪素0.5 g，丙酮酸鈉0.3 g，K2HPO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH7.2。

1.1.3主要試劑及儀器 TIANGEN?細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Genstar?PCR MIX、PCR儀(美國(guó)BIO-RAD T100)、電泳儀(美國(guó)BIO-RAD)、小型臺(tái)式高速離心機(jī)(Thermo 17R)以及恒溫培養(yǎng)箱(躍進(jìn)HH-B11)。

1.2 方法

1.2.1菌種分離培養(yǎng)及保存 將采集到的熱泉水樣10倍稀釋后，取100 μL涂布于R2A平板上，分別置于70、65、60、55、50、45、37以及25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行三區(qū)劃線，分離純化后置于對(duì)應(yīng)溫度培養(yǎng)，直至得到單一純菌，純化菌株用甘油管-80 ℃保存。

1.2.2細(xì)菌基因組DNA提取及16S rRNA擴(kuò)增 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒制備DNA模板，16S rRNA通用引物[12-13]27f(5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)以及1492r(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及條件參照文獻(xiàn)[14-16]進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送英淮捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.316S rRNA基因比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將獲得的序列在CLUSTAL_X program中進(jìn)行比對(duì)后[17]，與現(xiàn)有的純培養(yǎng)序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)及EzTaxon-e工具中進(jìn)行比對(duì)[18]，下載與比對(duì)菌株最相近菌株16S rRNA的基因序列，通過(guò)MEGA 5.0軟件[19]，采用最大擬自然法(maximum-likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹[20]，選擇Kimura’s two-parameter model[21]以Bootstrap 1000 次評(píng)價(jià)進(jìn)化樹分支聚類的穩(wěn)定性，進(jìn)行菌株的聚類及系統(tǒng)發(fā)育分析。通過(guò)circos 軟件作圖[22]，繪制溫度與不同屬間多樣性結(jié)果分布圖。使用R語(yǔ)言[23]繪制不同溫度壓力下熱泉細(xì)菌多樣性差異圖。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離結(jié)果

8個(gè)溫度梯度下，可培養(yǎng)細(xì)菌的菌落數(shù)量及多樣性最豐富的溫度為37 ℃。共獲得可培養(yǎng)細(xì)菌243株，其中25 ℃ 59株，37 ℃ 156株，45 ℃ 9株，50 ℃ 8株，55 ℃ 6株，60 ℃ 5株，65 ℃及70 ℃未分離出可培養(yǎng)細(xì)菌。經(jīng)過(guò)比對(duì)，所得細(xì)菌歸屬于25個(gè)種、20個(gè)屬、5個(gè)綱以及3個(gè)門。在屬間水平上，α-變形菌綱細(xì)菌的多樣性最為豐富，包含8個(gè)屬；其次為β-變形菌綱、γ-變形菌綱和放線菌綱。在菌株數(shù)量上，α-變形菌綱屬于優(yōu)勢(shì)類群，共82株，分屬于11個(gè)種。25 ℃時(shí)優(yōu)勢(shì)菌屬為Caulobacte屬(45.8%)，其次為Rhizobium屬(20.3%)和Zhizhongheella屬(11.9%)；37 ℃時(shí)，優(yōu)勢(shì)菌屬為Zhizhongheella屬(20.5%)、Vulcaniibacterium屬(18.6%)以及Caulobacter屬(12.8%)；45 ℃優(yōu)勢(shì)菌屬為Phenylobacterium屬(30%)；50和55 ℃時(shí)，Vulcaniibacterium屬及Geobacillus屬各占50%；60 ℃時(shí)分離出的細(xì)菌全部屬于Geobacillus屬。見圖1和圖2。

圖2 不同溫度梯度下熱泉可培養(yǎng)菌株的數(shù)量分布Fig.2 The strain amount distribution of culturable bacteria in a hot spring under different temperatures

2.2 不同溫度壓力下熱泉中菌株培養(yǎng)結(jié)果

在60、55、50、45、37以及25 ℃ 6種培養(yǎng)溫度下，分離出的菌株在群落分布上呈現(xiàn)明顯的差異。37 ℃培養(yǎng)菌株歸屬于兩個(gè)門[變形桿菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)]、4個(gè)綱[β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)以及放線菌綱(Actinobacteriac)]、 14個(gè)屬、16種；其中α-變形菌綱多樣性最豐富，包含8個(gè)屬；其余為β-變形菌綱(Betaproteobacteri)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)芽孢桿菌綱(Bacilli)。在種屬水平上，25 ℃分離菌株分屬于10個(gè)屬11種；α-變形菌綱為優(yōu)勢(shì)種群，包含7個(gè)屬；其次為β-變形菌綱包含2個(gè)屬，芽孢桿菌綱包含1個(gè)屬。45、50、55以及60 ℃分離菌株分屬于α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)下 5個(gè)屬。見圖3。

圖3 不同溫度壓力下熱泉細(xì)菌多樣性差異Fig.3 The differential diversity of culturable bacteria in a hot spring under different temperatures

2.3 不同培養(yǎng)溫度下分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

分離純化菌株，根據(jù)形態(tài)特征、16S rRNA 序列比對(duì)合并，對(duì)分離出的20個(gè)屬，每個(gè)溫度選擇1株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，共31株分離菌株，23株標(biāo)準(zhǔn)菌株，構(gòu)建 M-L系統(tǒng)進(jìn)化樹。分離菌株未出現(xiàn)明顯的因溫度脅迫而出現(xiàn)的聚類現(xiàn)象，見圖4。

圖4 基于分離菌株16S rRNA基因序列構(gòu)建M-L系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 Construction of M-L phylogenetic evolutionary tree in term of 16S rRNA sequences

3 討論

本研究首次對(duì)貴州青巖古鎮(zhèn)未開發(fā)熱泉進(jìn)行了細(xì)菌類群的微生物多樣性初探，考慮到熱泉內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏，且本次研究所采集的樣品為水樣，故選擇使用寡營(yíng)養(yǎng)、水體微生物培養(yǎng)基R2A培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基與常用的2216及LB培養(yǎng)基相比，可避免由于營(yíng)養(yǎng)條件豐富而導(dǎo)致的優(yōu)勢(shì)菌株占比大的問(wèn)題。本次分離共獲得243株可培養(yǎng)細(xì)菌，其中變形桿菌門為熱泉中最重要的微生物類群，與其他學(xué)者對(duì)熱泉樣品進(jìn)行純培養(yǎng)的研究結(jié)果相一致[24]。本研究?jī)?yōu)勢(shì)綱目為α-變形桿菌綱，其次為β-變形桿菌綱，相較于其它地區(qū)(平頂山[25]及云南騰沖[26])的研究報(bào)道存在一定差異。出現(xiàn)差異可能與熱泉本身的溫度相關(guān)，平頂山等為中低溫?zé)崛?，云南騰沖為高溫?zé)崛崾究赡懿煌赜驘崛⑸锶郝浯嬖诓町?，亦可能與分離樣本類型不同相關(guān)。目前對(duì)熱泉采樣進(jìn)行純培養(yǎng)的樣本多為熱泉底泥或菌席，本次分離樣本為熱泉水樣。以上原因可能導(dǎo)致了熱泉中細(xì)菌多樣性差異。本次研究共分離到約40%的高溫細(xì)菌類群，如Vulcaniibacterium屬、Rhizobium屬和Brevundimonas屬，獲得大量的高溫微生物資源，此外還分離出了部分放線菌菌株，棲息在熱泉中的放線菌具有獨(dú)特的代謝活性，具有巨大的開發(fā)利用價(jià)值；其中Vulcaniibacterium屬潛在新種，更是表明了該未開發(fā)熱泉中可能存在的其它未分出的新分類單元。本研究對(duì)貴州當(dāng)?shù)責(zé)崛獦O端環(huán)境的微生物資源和基因資源進(jìn)行了初步調(diào)查，分離得到了具有潛在開發(fā)利用價(jià)值的微生物資源，為當(dāng)?shù)責(zé)崛⑸镔Y源的開發(fā)和保護(hù)有重要的理論意義。

溫度是調(diào)節(jié)微生物代謝和生長(zhǎng)活力的最重要因素，直接影響微生物細(xì)胞中的代謝反應(yīng)，是決定微生物多樣性種類豐度和分布的重要因素之一。溫度對(duì)微生物類群施加壓力，溫度脅迫下可能導(dǎo)致特定的菌群選擇。目前模擬溫度脅迫下的微生物多樣性變化，多集中在一般自然環(huán)境中，如土壤、淡水中，研究對(duì)象包括了細(xì)菌、浮游生物及海藻等[27-28]，對(duì)極端環(huán)境中生存的微生物，尤其是熱泉環(huán)境，在溫度影響下其多樣性變化是否存在一定規(guī)律，與自然環(huán)境的研究結(jié)果是否存在差異尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本次研究以極端環(huán)境中的熱泉為研究對(duì)象，進(jìn)行了溫度對(duì)微生物多樣性影響的研究，得出在用于分離的各種培養(yǎng)溫度中，熱泉中可培養(yǎng)微生物分離多樣性及豐度表現(xiàn)出單峰性，具體表現(xiàn)為25～37 ℃增長(zhǎng)直至最優(yōu)，45～60 ℃后迅速下降，37 ℃能分離出數(shù)量較多且種類較豐富的微生物。M-L法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示不同溫度的純養(yǎng)結(jié)果并未因溫度脅迫而顯示出聚類現(xiàn)象，但在種群分布及數(shù)量上存在差異。本研究分離結(jié)果表明，過(guò)高的培養(yǎng)溫度和生物多樣性喪失是協(xié)同作用的，在熱脅迫下，物種間多樣性降低，可能使各物種間互補(bǔ)性增加，這與García F C等[26]對(duì)自然環(huán)境的研究結(jié)果相一致，說(shuō)明在熱泉這一極端環(huán)境中微生物的多樣性差異，對(duì)溫度的響應(yīng)同自然環(huán)境一致。本研究通過(guò)人為的溫度脅迫，分析熱泉中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性的變化規(guī)律，推測(cè)在熱泉這一極端環(huán)境中，微生物群體可能存在的相互作用及其機(jī)制；同時(shí)也為熱泉樣品在進(jìn)行生物多樣性研究時(shí)，培養(yǎng)溫度的選擇上提供一定的參考。