向潔， 曹坤， 董陽(yáng)婷， 曾曉曉， 徐毅， 冉龍艷， 鄧婕， 官志忠,**

(1．貴州醫(yī)科大學(xué)附院 病理科， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

阿爾茲海默病(alzheimer’s disease,AD)又稱老年性癡呆，是一種主要在老年期發(fā)生的神經(jīng)元退行性變疾病，以進(jìn)行性癡呆為主要特征，主要神經(jīng)病理學(xué)改變有老年斑增多、神經(jīng)元纖維纏結(jié)形成、神經(jīng)元喪失及腦萎縮[1]。近年來(lái)隨著以清除Aβ為主流的臨床III期治療藥物研究的失敗，進(jìn)一步闡明AD的分子發(fā)生機(jī)制、分析臨床研究失敗的原因、以及采取新的治療途徑等成為當(dāng)前AD研究的熱點(diǎn)[2]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一種含有金屬元素的活性蛋白酶，可分為銅-鋅-SOD(Cu-Zn-SOD，SOD-1)、錳-SOD(Mn-SOD，SOD-2)和鐵-SOD(Fe-SOD，SOD-3)三種。其中，SOD-2是線粒體內(nèi)重要的抗氧化物酶，可將超氧化物分解為水和過(guò)氧化氫，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。沉默信息調(diào)節(jié)因子-3(silent information regulator 3，SIRT3)是一種依賴NAD+的去乙酰化酶，主要定位于線粒體，與多種生物學(xué)功能密切相關(guān)，其中包括ATP生成，氧自由基清除及維持線粒體穩(wěn)態(tài)等[3]。SOD-2及SIRT3都參與調(diào)節(jié)線粒體功能、抵抗氧化應(yīng)激，在神經(jīng)退行性疾病中起著關(guān)鍵作用。有研究表明，SIRT3能通過(guò)提高SOD-2活性，從而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化的作用[4]。另外SIRT3協(xié)同SOD-2在衰老、致癌等方面也有著至關(guān)重要的作用[5-6]，但它們?cè)贏D發(fā)病機(jī)制中的作用報(bào)道甚少，本研究以人腦組織為標(biāo)本，探討AD患者和對(duì)照組的不同腦區(qū)SOD-2和SIRT3的表達(dá)、分布及兩者的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1抗體試劑 兔多克隆抗SOD-2抗體(美國(guó)genetex公司)，小鼠多單隆抗SIRT3抗體(美國(guó)Santa Cruze公司)，山羊抗鼠IgG標(biāo)記cy-3和山羊抗兔IgG標(biāo)記488(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，免疫組織化學(xué)通用二步法試劑盒、DAB顯色試劑盒、PBS緩沖液、檸檬酸鹽、山羊血清(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)

1.1.2人腦樣本 由荷蘭阿姆斯特丹人腦組織標(biāo)本庫(kù)提供AD患者(AD組)及正常人(對(duì)照組)各10例尸體解剖后腦組織標(biāo)本蠟塊，有大腦顳葉皮質(zhì)、額葉皮質(zhì)、海馬及小腦等不同腦區(qū)。AD患者死亡時(shí)平均年齡為(81.5±7.1)歲，正常對(duì)照組為(79.4±9.2)歲；AD患者和對(duì)照組的死后間隔時(shí)間(PMI，死亡和尸檢間隔)分別為(5.1±1.0)h和(8.0±3.4)h，研究對(duì)象的臨床和神經(jīng)病理學(xué)特征見(jiàn)表1。AD診斷根據(jù)患者的病史、臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查，排除了其他可能的癡呆原因，同時(shí)根據(jù)美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病、語(yǔ)言交流障礙和卒中研究所標(biāo)準(zhǔn)對(duì)AD患者癡呆嚴(yán)重程度進(jìn)行了臨床分級(jí)。患者與對(duì)照組腦組織標(biāo)本在各種因素上均具有良好的匹配性，包括生前和死后相關(guān)因素。生前因素包括年齡、性別、疾病狀態(tài)和死亡時(shí)間，死后因素包括死后尸檢時(shí)間、固定方式、保存時(shí)間等[7-9]。所提供的AD樣本患者均未接受膽堿能抑制劑等特殊治療。本研究獲得貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2018第67號(hào))。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色 將不同腦區(qū)的石蠟包埋標(biāo)本行腦組織切片，厚度6 μm，60～65 ℃烤片1 h，將切片置于二甲苯及不同濃度乙醇脫蠟水化，0.25% PBST緩沖液洗滌切片；隨后采用微波修復(fù)對(duì)切片進(jìn)行組織抗原修復(fù)，待切片自然冷卻后于切片上滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min；山羊血清工作液封閉1 h，滴加抗SOD-2(1∶200)、抗SIRT3(1∶200)抗體，4 ℃過(guò)夜，PBST緩沖液沖洗，滴加適量的反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20 min，PBST緩沖液再次沖洗，滴加增強(qiáng)酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育20 min；加入適量新鮮配置的DAB顯色液，室溫孵育5～8 min后，清水終止顯色；脫水、透明，中性樹(shù)膠封片，鏡檢。

表1 兩組研究對(duì)象的臨床和神經(jīng)病理學(xué)特征Tab.1 Clinical and neuropathological characteristics of the patients with AD and control subjects

注：AD1～AD10為AD患者，NFT為根據(jù)神經(jīng)纖維纏結(jié)的分布和數(shù)量對(duì)AD的分級(jí)，Aβ為根據(jù)老年斑對(duì)AD的分級(jí)

1.2.2結(jié)果判定 每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野(原始放大倍數(shù)為200倍)，將5個(gè)視野的陽(yáng)性蛋白表達(dá)平均灰度值作為每一張切片的陽(yáng)性蛋白表達(dá)的灰度值。最后計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以及SIRT3、SOD-2平均光密度(IOD)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SOD-2表達(dá)

腦組織中SOD-2的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖1A)。與對(duì)照組相比，AD組顳葉、額葉、海馬等腦區(qū)中SOD-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(圖1B)及IOD值(圖1C) 均降低(P<0.05)；AD組和對(duì)照組小腦中SOD-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及IOD值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：A放大200倍、白框中放大400倍，(1)與對(duì)照組比較，P<0.05圖1 SOD-2在AD組及對(duì)照組大腦顳葉、額葉、海馬和小腦的分布及表達(dá)(DAB染色)Fig.1 Immunohistochemical staining for SOD2 in cerebral temporal lobe, frontal lobe, hippocampus and cerebellum of patients with AD and control subjects

2.2 SIRT3表達(dá)

腦組織中SIRT3主要表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖2A)。半定量分析顯示，SIRT3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在AD患者顳葉、額葉、海馬中均少于對(duì)對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在小腦中兩組SIRT3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2B；同樣，IOD值在AD組顳葉、額葉、海馬中均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在小腦中兩組IOD值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2C。

注：A放大200倍、白框中放大400倍,(1)與對(duì)照組比較，P<0.05圖2 SIRT3在AD患者及對(duì)照組大腦顳葉、額葉、海馬和小腦分布及表達(dá)(DAB染色)Fig.2 Immunohistochemical staining for SIRT3 in cerebral temporal lobe, frontal lobe, hippocampus and cerebellum of AD patients and control subjects

2.3 AD患者SOD-2與SIRT3表達(dá)的關(guān)系

AD患者腦組織中，SOD-2與SIRT3蛋白表達(dá)水平在大腦顳葉(r2=0.425，P=0.041)、額葉(r2=0.411，P=0.046)及海馬(r2=0.402，P=0.049)中呈正相關(guān)，說(shuō)明隨著SOD-2蛋白水平降低，SIRT3蛋白水平也降低(圖3A、B、C)。在小腦中，這兩種蛋白之間則沒(méi)有相關(guān)性(r2=0.031，P=0.624)，見(jiàn)圖3D。

3 討論

AD病因十分復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境等多種因素。大量研究表明，氧化應(yīng)激損傷是AD發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要的影響因素[10]。Aβ的大量蓄積可直接破壞線粒體電子傳遞鏈，從而增加ROS的產(chǎn)生[11]，并且影響ATP的生成[12]。另一方面，作為氧化代謝的重要場(chǎng)所，同時(shí)也是ROS產(chǎn)生和消除的重要場(chǎng)所。線粒體內(nèi)ROS水平升高，進(jìn)一步可導(dǎo)致線粒體凋亡[13]。本研究以定位于線粒體的關(guān)鍵蛋白SOD-2及 SIRT3作為研究對(duì)象，探討兩者在AD患者中的表達(dá)及相關(guān)性。研究結(jié)果顯示，AD患者顳葉、額葉、海馬中，SOD-2及 SIRT3表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低，而在小腦未見(jiàn)明顯改變。

基于對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷的AD治療研究中發(fā)現(xiàn)，SOD-2基因多態(tài)性與AD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[14]，擬AD動(dòng)物模型Tg2576小鼠中SOD-2的過(guò)表達(dá)可降低小鼠腦組織海馬過(guò)氧化物的含量，并可預(yù)防記憶缺陷[15]。進(jìn)一步證實(shí)，SOD-2是線粒體內(nèi)主要的氧自由基清除劑，在維持線粒體功能、體內(nèi)外抗氧化損傷中發(fā)揮著主要作用。

圖3 AD患者大腦顳葉、額葉、海馬和小腦中SOD-2與SIRT3蛋白表達(dá)的相關(guān)性Fig.3 The correlation between SOD2 and SIRT3 in SOD-2 in cerebral temporal lobe, frontal lobe, hippocampus and cerebellum of AD patients

Sirtuins蛋白家族是一組依賴煙腺嘌呤二核苷酸(NAD)的去乙?；鞍?，家族包括7個(gè)成員，其中SIRT3的活性形式存在于線粒體基質(zhì)，通過(guò)去乙?；饔谜{(diào)節(jié)線粒體代謝，包括ATP的產(chǎn)生，ROS的代謝和細(xì)胞凋亡。SIRT3基因與衰老密切相關(guān)[16]，且其升高能減輕Aβ的神經(jīng)毒性，介導(dǎo)對(duì)神經(jīng)退行性疾病的保護(hù)作用[17]。

SOD-2作為氧化應(yīng)激反應(yīng)中最重要最基礎(chǔ)的抗氧化酶，可能與共同表達(dá)在線粒體的SIRT3有著密切的聯(lián)系，或許介導(dǎo)其神經(jīng)保護(hù)作用。研究表明，SOD-2與SIRT3聯(lián)系密切， SIRT3是通過(guò)SOD-2的增多來(lái)實(shí)現(xiàn)抗ROS的作用[18]。在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，SIRT3可通過(guò)改變SOD-2表達(dá)，清除線粒體內(nèi)的ROS，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，而敲除SOD-2和SIRT3基因后，可抑制成骨細(xì)胞分化[19]。另一方面，抑制SIRT3-SOD-2-線粒體信號(hào)通路，可誘導(dǎo)血管炎癥，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化[20]。而在神經(jīng)退行性疾病中，模擬亨廷頓病和癲癇的SIRT3缺陷小鼠表現(xiàn)出更多的神經(jīng)元損傷，這種損傷最主要原因也與SOD-2含量降低有關(guān)[21]。目前兩者在AD發(fā)病機(jī)制的研究較少，本研究結(jié)果顯示，SOD-2 及SIRT3在AD病變較重的腦區(qū)，如顳葉、額葉、海馬中表達(dá)減少，且在這3個(gè)腦區(qū)中，SOD-2表達(dá)與SIRT3表達(dá)存在正相關(guān)，說(shuō)明SOD-2含量減少，SIRT3表達(dá)也減少，由此推測(cè)SOD-2與SIRT3共同參與了AD發(fā)病過(guò)程中線粒體能量代謝障礙的過(guò)程，從而導(dǎo)致抗氧化應(yīng)激作用降低，可能是AD氧化應(yīng)激假說(shuō)的一個(gè)重要因素。

綜上所述，AD患者顳葉、額葉、海馬等腦區(qū)中SOD-2和SIRT3表達(dá)降低，SOD-2表達(dá)水平與SIRT3表達(dá)水平呈正相關(guān)，可能與該病的神經(jīng)病理學(xué)改變有關(guān)。