蔡琳俐 王 瑋 付文錕 潘德全 葉江輝 朱 樺 程 通 夏寧邵

(廈門大學生命科學學院，國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，廈門361102)

水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus，VZV)是水痘及帶狀皰疹兩種疾病的共同病原體。水痘一般發(fā)生于人的嬰幼兒及兒童時期，由VZV初次感染所引起，隨后VZV可長期潛伏于人的神經(jīng)節(jié)，在患者年老或免疫力降低時可能再激活引發(fā)帶狀皰疹，愈后常導致后遺神經(jīng)痛，嚴重影響患者生活質(zhì)量[1-5]。

VZV是皰疹病毒科α亞科的雙鏈DNA病毒，其基因組大小約為125 kb，包含至少70個開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼至少68個氨基酸[6]。VZV病毒顆粒具有典型的皰疹病毒結(jié)構(gòu)，從內(nèi)到外分別為：包裹DNA基因組的核衣殼、無固定形狀的皮層、宿主細胞膜及病毒糖蛋白組成的囊膜[7]。衣殼的形成是VZV成熟病毒顆粒產(chǎn)生過程的第一步且也是關鍵步驟之一。根據(jù)與VZV 同源性相近的1型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus 1，HSV-1)的基因組推測，VZV 衣殼組裝可能需要ORF20、ORF23、ORF33、ORF33.5、ORF40 和ORF41 6種病毒蛋白，然而目前關于確切VZV衣殼組成蛋白的種類還有待證實[8]。VZV ORF40類似同源蛋白HSV-1 VP5(UL19)可能是最主要的病毒衣殼蛋白，其基因組包含4 224個堿基，編碼1 396個氨基酸，蛋白分子量大小約為153 kD。

近年來，關于VZV ORF40蛋白的研究報道較少。Chaudhuri等[8]發(fā)現(xiàn)ORF40蛋白不具備核定位信號，但可在與另一個具有核定位信號的衣殼蛋白ORF23共表達時被攜帶進入細胞核，這可能對VZV衣殼在細胞核內(nèi)組裝十分重要。另外，Inoue等[9]發(fā)現(xiàn)一種新型的抗VZV藥物(35B2)可通過與ORF40蛋白相互作用抑制VZV衣殼組裝，進而影響VZV的復制，這說明ORF40蛋白在VZV衣殼組裝過程中扮演重要角色。然而，目前ORF40蛋白在VZV感染細胞中參與的蛋白-蛋白相互作用及其在VZV衣殼組裝過程中的功能等都尚不清楚，而獲得其特異性單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)對ORF40蛋白性質(zhì)與功能研究具有非常重要的意義。

本研究應用生物軟件分析設計并合成了ORF40蛋白中親水性與免疫原性較好的多肽片段， 將合成多肽與牛血清蛋白偶聯(lián)后免疫小鼠，采用雜交瘤技術(shù)制備獲得特異性高、反應活性良好的抗VZV ORF40蛋白的單克隆抗體。同時，本研究將該抗體用于Western blot與免疫熒光檢測，對VZV感染細胞中的ORF40蛋白表達、定位以及對純化VZV衣殼顆粒ORF40蛋白的包含情況進行了初步探究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 次黃嘌呤、胸腺嘧啶、氨基喋呤、弗式完全佐劑和不完全佐劑、TRITC標記的 GAM IgG抗體、牛血清白蛋白(BSA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、山羊血清購自美國Sigma公司；DAPI購自美國Invitrogen公司； Anti-β-tubulin的小鼠單克隆抗體、HRP 標記的 GAM IgG抗體購自美國 CST 公司；Super Signal West Pico Substrate試劑盒購自Pierce公司；RPMI1640、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰酶及胎牛血清(FBS)購自 Thermo Fisher Scientific 公司；銀染、ELISA試劑盒、純化實驗等其他常用化學試劑購自西隴化工股份有限公司。Anti-gE、anti-ORF23的小鼠單克隆抗體由本實驗室自行生產(chǎn)。

1.1.2菌種與質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α購自TianGen公司；pCDNA3.1-ORF40真核表達質(zhì)粒由北京金唯智生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.3細胞株、病毒株和實驗動物 小鼠骨髓瘤細胞SP2/0、人胚胎腎細胞293T、人視網(wǎng)膜色素上皮細胞ARPE-19由本實驗室保存；VZV pOka病毒株由美國羅格斯大學朱樺教授實驗室提供[10]；6～8周齡的BALB/c 雌鼠和F1小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2方法

1.2.1多肽合成與偶聯(lián) 從NCBI獲得VZV pOka毒株的ORF40基因與氨基酸序列，將獲得的序列信息通過Protean軟件進行親疏水性及免疫原性分析，選擇ORF40 N端親水性較高的包含15個氨基酸的多肽片段ORF40-N1-15：MTTVSCPANVITTTE，委托上海生工進行合成。分別取2 mg多肽干粉溶于500 μl 2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物(MES)緩沖液、2 mg BSA 溶于200 μl MES緩沖液以及10 mg EDC溶于1 ml ddH2O，先將500 μl的多肽溶液與200 μl的BSA溶液混合，再加入100 μl EDC溶液，室溫混勻2 h 后至PBS透析，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2單克隆抗體制備 將BSA偶聯(lián)的ORF40多肽抗原與等體積的弗氏完全佐劑(初次免疫)或不完全佐劑(加強免疫)混合成均勻的乳化狀態(tài)后，以多點注射的方式、按100 μg/只的劑量注射到BALB/c 雌鼠四肢皮下，首次免疫后分別在第2和第4周進行加強免疫，每次免疫前對小鼠進行眼內(nèi)眥采血。最后在第6周使用相同的抗原進行脾臟免疫，3 d后取免疫小鼠的脾臟與SP2/0按照常規(guī)方法進行細胞融合獲得雜交瘤細胞[11]。采用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行克隆化，取雜交瘤細胞培養(yǎng)上清通過ELISA方法篩選特異性好、與免疫原反應強的單克隆。經(jīng)過至少2輪克隆化篩選后，最終獲得能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。將獲得的單克隆雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)后，注射至F1小鼠腹腔，待小鼠腹部腫脹后收集腹水，并通過Protein-A親和層析柱純化獲得單克隆抗體。

1.2.3篩選雜交瘤細胞的間接ELISA檢測 將合成的ORF40蛋白多肽用碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液(pH9.6)進行稀釋，使其濃度為100 μg/ml，再按100 μl/孔 的量包被在96孔微孔板上，4℃包被過夜。用1×PBST緩沖液洗板3次后，每孔加入200 μl含有3%BSA的PBS緩沖液于37℃孵育2 h，甩干后真空密封保存?zhèn)溆?。檢測時每孔加入50 μl雜交瘤細胞上清，37℃孵育1 h。用1×PBST緩沖液清洗5次后，每孔加入100 μl HRP標記的GAM IgG抗體(1∶5 000稀釋)于37℃孵育30 min。再次用1×PBST清洗5次后，每孔加入100 μl顯色液于37℃孵育15 min，加入50 μl終止液后在酶標儀上進行讀值。

1.2.4VZV病毒衣殼的初步純化 準備5×107個已感染VZV pOka且完全病變的ARPE-19細胞，清洗后消化并收集細胞懸液。經(jīng)Dounce勻漿處理后1 000 g、4℃離心10 min，收取上清。加入1%NP40處理后，通過20%～50%(w/v)蔗糖密度梯度離心，使用Beckman SW28轉(zhuǎn)頭17 000 r/min、4℃離心1 h，取最下層分離液至PBS溶液中透析，透射電鏡觀察并在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5銀染檢測 向純化的病毒衣殼或VZV pOka感染的ARPE-19細胞裂解液加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴處理10 min后跑SDS-PAGE膠。將蛋白膠置于固定液(200 ml甲醇加250 μl甲醛后，ddH2O定容至500 ml)中固定10 min。ddH2O洗2次后，加入0.02%(w/v)硫代硫酸鈉反應1 min。ddH2O洗2次后，加入0.5%(w/v)AgNO3反應10 min左右。ddH2O洗2次后，加顯色液顯影后終止，再置于ddH2O中拍照。

1.2.6Western blot檢測 分別將轉(zhuǎn)染真核表達質(zhì)粒pCDNA3.1-ORF40或pCDNA3.1后48 h收獲的293T細胞以及感染(感染復數(shù)MOI=0.3)或未感染VZV pOka病毒后48 h收獲的ARPE-19細胞，用含1 mmol/L PMSF和1%Triton X-100 的PBS溶液裂解后獲得蛋白樣品。經(jīng)12%SDS-PAGE分離后通過濕電轉(zhuǎn)膜儀使膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，使用5%脫脂牛奶4℃封閉過夜，以VZV ORF40單克隆抗體(1 μg/ml)為一抗于37℃孵育1 h，用PBST緩沖液洗滌5次后，以HRP標記的GAM IgG抗體(按1∶5 000稀釋)為二抗于37℃孵育30 min，用PBST洗滌5次后使用Super Signal West Pico Substrate試劑盒顯色并拍照。

1.2.7免疫熒光檢測 分別將293T細胞和ARPE-19細胞接種于預先加入潔凈玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中，質(zhì)粒pCDNA3.1-ORF40或pCDNA3.1轉(zhuǎn)染到293T細胞，VZV pOka病毒(MOI=0.001)感染或不感染ARPE-19細胞，37℃培養(yǎng)48 h。隨后在室溫環(huán)境下，使用4%多聚甲醛固定細胞，15 min后PBS洗1次。含0.3%Triton X-100的PBS通透10 min，PBS洗1次。山羊血清封閉1 h，再以VZV ORF40單克隆抗體(1 μg/ml)為一抗于37℃孵育1 h。PBS洗3次后，以TRITC標記的GAM IgG為二抗避光孵育30 min，DAPI染色5 min，PBS洗滌3次，封片后使用激光共聚焦顯微鏡進行拍照。

2 結(jié)果

2.1VZV ORF40單克隆抗體的制備與鑒定 本研究將合成多肽ORF40-N1-15偶聯(lián)BSA后免疫小鼠，通過雜交瘤技術(shù)、克隆化結(jié)合間接ELISA篩選，獲得1株可穩(wěn)定分泌抗VZV ORF40蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，經(jīng)腹水生產(chǎn)與純化獲得相應的單克隆抗體10F2。為進一步鑒定其特異性、反應性，使用單抗10F2對轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-ORF40或pCDNA3.1 48 h的以及未做處理的293T細胞進行Western blot和免疫熒光檢測。Western blot檢測結(jié)果顯示，單抗10F2可與轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-ORF40的293T細胞裂解液有良好的特異性反應，在130～180 kD 的蛋白marker之間檢出清晰且單一的蛋白條帶(圖1A)，約153 kD，與ORF40蛋白的理論大小相一致，同時與未處理和轉(zhuǎn)染pCDNA3.1的293T細胞裂解液無任何反應。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，單抗10F2與轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-ORF40的293T細胞有較強的特異性反應，且發(fā)現(xiàn)外源表達的ORF40蛋白主要彌散分布在細胞質(zhì)中，同時與轉(zhuǎn)染pCDNA3.1空載的293T細胞沒有非特異性反應(圖1B)。以上結(jié)果表明，單抗10F2可特異識別VZV ORF40蛋白，可用于后續(xù)實驗。

圖1 抗VZV-ORF40單克隆抗體10F2性質(zhì)鑒定Fig.1 Characterization of anti-VZV-ORF40 mAb 10F2Note:A.Western blot of cell extracts of 293T cells transfected or not with pCNDA3.1 or pCNDA3.1-ORF40 using anti-VZV-ORF40 mAb 10F2.1.Untreated 293T cells;2.293T cells transfected with pCNDA3.1;3.293T cells transfected with pCNDA3.1-ORF40.B.Immunofluorescence analysis of 293T cells transfected with pCNDA3.1 or pCNDA3.1-ORF40 using anti-VZV-ORF40 mAb 10F2.

圖2 ORF40在VZV感染細胞中的表達與亞細胞定位Fig.2 Expression and subcellular localization of ORF40 in VZV-infected cellsNote:A.Western blot of cell extracts of ARPE-19 cells uninfected or infected with VZV pOka using anti-VZV-ORF40 mAb 10F2.1.Uninfected ARPE-19 cells;2.ARPE-19 cells infected with VZV pOka.B.Immunofluorescence analysis of ARPE-19 cells uninfected or infected with VZV pOka using anti-VZV-ORF40 mAb 10F2.

2.2VZV 感染細胞中ORF40的Western blot及免疫熒光檢測 收集VZV pOka感染48 h后的ARPE-19細胞及未感染的ARPE-19陰性細胞，分別裂解后使用單抗10F2對其進行Western blot檢測。結(jié)果顯示，單抗10F2與VZV pOka感染的ARPE-19細胞裂解液發(fā)生特異性反應，且不與未感染的ARPE-19細胞發(fā)生反應，其檢出的蛋白條帶在130～180 kD之間，約為153 kD(圖2A)，與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達的ORF40蛋白(圖1A)以及理論大小一致。

進一步使用單抗10F2對VZV pOka感染48 h后的ARPE-19細胞及未感染的ARPE-19陰性細胞做免疫熒光檢測。結(jié)果顯示，單抗10F2同樣與VZV感染的ARPE-19細胞發(fā)生較強的特異性反應，且發(fā)現(xiàn)與單獨外源表達的ORF40細胞質(zhì)定位不同，本實驗檢出的ORF40蛋白絕大部分定位于細胞核內(nèi)，呈彌散分布或者在核周呈點狀分布(圖2B，白色箭頭)，部分細胞的細胞質(zhì)內(nèi)也能檢測到ORF40(圖2B，綠色箭頭)，這樣的定位變化可能是由于ORF40蛋白和其他病毒蛋白相互作用，共同參與細胞核內(nèi)的衣殼組裝而引起的。同時，單抗10F2與未感染的ARPE-19細胞沒有任何非特異性反應。

2.3VZV衣殼中ORF40蛋白的Western blot檢測 為進一步探究單抗10F2是否可用于對VZV衣殼中ORF40蛋白的檢測，本研究通過蔗糖密度梯度離心法從VZV感染的ARPE-19細胞中初步純化獲得VZV衣殼顆粒，通過銀染(圖3A)和透射電鏡(圖3B)分析可見獲得的VZV衣殼純度較好。隨后，通過Western blot分析發(fā)現(xiàn)(圖3C)，ORF40蛋白與另一種小衣殼蛋白ORF23均能在純化的VZV衣殼中檢出，且無法檢出病毒囊膜蛋白(如gE)，也基本不包含細胞成分(如β-tubulin)，而以上蛋白在VZV感染細胞裂解液中均能檢出。該結(jié)果證明，單抗10F2對VZV衣殼中ORF40蛋白同樣具有高效且特異的識別能力。

圖3 10F2可用于VZV衣殼中ORF40蛋白檢測Fig.3 Detection of ORF40 contained in VZV capsids using mAb 10F2Note:A.Silver staining analysis of purified VZV capsids and cell extracts of ARPE-19 cells infected with VZV pOka using anti-VZV-ORF40 mAb 10F2；B.Transmission electron microscopy of purified VZV capsids；C.Western blot analysis of purified VZV capsids and cell extracts of ARPE-19 cells infected with VZV pOka using anti-VZV-ORF40 mAb 10F2.1.Purified VZV capsids;2.ARPE-19 cells infected with VZV pOka;M.Protein marker.

3 討論

VZV的有效擴散依賴于大量感染性病毒顆粒的產(chǎn)生，而高度有序的病毒衣殼蛋白元件的合成與衣殼組裝是VZV感染與制周期的關鍵步驟，為設計抗病毒藥物提供了良好靶標。雖然通過HSV-1的同源推測已經(jīng)大致確定了VZV衣殼蛋白的種類及功能，但是關于VZV衣殼蛋白的性質(zhì)、功能、蛋白-蛋白相互作用及其組裝機制仍缺少研究報道。

本研究以VZV主要衣殼蛋白ORF40為研究對象，選取其N端的第1～15個氨基酸多肽片段偶聯(lián)BSA作為免疫原，通過小鼠免疫、雜交瘤技術(shù)及3輪克隆化篩選獲得了1株可穩(wěn)定分泌抗VZV ORF40蛋白的雜交瘤單抗細胞，并將純化獲得的單抗命名為10F2。通過Western blot檢測，單抗10F2可以特異性識別質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細胞和VZV感染的ARPE-19細胞中表達的ORF40蛋白，顯示出約153 kD 條帶。本研究將單抗10F2用于免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)VZV ORF40蛋白在單獨質(zhì)粒外源表達時因缺乏核定位信號而在細胞質(zhì)內(nèi)彌散定位，而在VZV感染細胞中主要是細胞核定位。而且，在VZV感染細胞中ORF40蛋白除了在細胞核內(nèi)彌散定位，也呈核周點狀聚集分布，這些點狀部位可能是病毒集中組裝或運送出核的場所。ORF40在VZV感染細胞中的定位變化可能與其和其他病毒蛋白、特別是衣殼蛋白相互作用并入核組裝VZV衣殼顆粒相關。在HSV-1中，ORF40的同源蛋白VP5就是通過與其他衣殼蛋白VP19C 或VP22a 相互作用進入細胞核，進而再與pre-VP22a 組裝成病毒殼粒的基本框架[12,13]。另外，VZV感染細胞的細胞質(zhì)內(nèi)偶爾也能檢測到ORF40蛋白，這可能是出核后聚集在胞質(zhì)內(nèi)準備或正在進行二次組裝過程的衣殼顆粒。本研究還應用單抗10F2對純化的VZV衣殼顆粒進行檢測，Western blot檢測結(jié)果顯示該單抗對衣殼顆粒中的ORF40蛋白同樣具有較好的特異性識別能力，該結(jié)果也為ORF40蛋白屬于VZV衣殼蛋白提供了直接證明。該單抗可用于后續(xù)VZV衣殼蛋白的成分分析與相互作用研究。

綜上所述，本研究成功制備了抗VZV ORF40蛋白的單克隆抗體10F2，該抗體特異性強、反應性好。本研究應用該抗體確定了VZV感染細胞內(nèi)ORF40蛋白的表達、亞細胞定位以及VZV衣殼顆粒包含的ORF40，這些工作為今后深入開展VZV ORF40蛋白性質(zhì)、功能以及VZV衣殼組裝相關研究奠定基礎。