俞濟榮 劉璘琛 許圣淳 王鳳梅

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院腎內(nèi)科，南京210009)

急性腎損傷是一種常見的臨床綜合征，其中缺血再灌注是誘發(fā)腎損傷的主要原因之一，而炎癥反應(yīng)是誘發(fā)缺血再灌注腎組織損傷的生理基礎(chǔ)[1]。腎小管上皮細胞是急性腎損傷中的靶細胞之一，其對缺血缺氧、膿毒血癥等十分敏感，腎小管上皮細胞分泌的炎癥因子也是腎臟炎癥介質(zhì)的主要來源之一[2,3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Silence information regulator 1,SIRT1)在機體新陳代謝、基因轉(zhuǎn)錄、細胞分裂、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等中具有重要作用，其參與神經(jīng)性疾病、糖尿病、腎組織損傷、心血管系統(tǒng)疾病等多種疾病的發(fā)生，在人體內(nèi)的多種組織中廣泛表達[4-6]。最近的研究顯示，SIRT1在順鉑等藥物引起的急性腎損傷、缺血再灌注引起的急性腎損傷中表達下調(diào)，可能參與腎小管上皮細胞損傷發(fā)生[7,8]。本實驗擬通過基因轉(zhuǎn)染、缺氧復(fù)氧腎小管上皮細胞損傷模型構(gòu)建等方法，探討SIRT1在缺氧復(fù)氧腎小管上皮細胞炎性損傷中的作用，為明確急性腎損傷發(fā)生機制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 人腎小管上皮細胞HK-2購自美國ATCC ；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green qRT-PCR試劑盒購自日本TOYOBO；兔抗Caspase-11抗體購自美國STANTA CRUZE；兔抗CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein C/EBP,CHOP)抗體購自美國Upstate；腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量測定試劑盒、白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)含量測定試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；兔抗SIRT1抗體購自美國PL Laboratories；pcDNA3.1-SIRT1購自上海銳賽生物技術(shù)有限公司;X-treme GENE HP DNA Transfection Reagant購自瑞士Roche。

1.2方法

1.2.1細胞分組處理 HK-2細胞在8%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，細胞放在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后，細胞長滿瓶底以后，用0.25%的胰蛋白酶消化。缺氧復(fù)氧腎小管上皮細胞模型構(gòu)建：HK-2細胞缺氧復(fù)氧模型構(gòu)建參照文獻[9]，在缺氧前，將細胞培養(yǎng)液更換成PBS溶液，細胞放在含有1%O2、94%N2、5%CO2混合氣體中缺氧孵育4 h。把PBS換成正常細胞培養(yǎng)液，放在5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。將缺氧復(fù)氧處理后的HK-2細胞記為H/R組，把未經(jīng)缺氧復(fù)氧處理的HK-2細胞記為Control組，用qRT-PCR和Western blot方法檢測細胞中SIRT1的表達變化。

HK-2細胞轉(zhuǎn)染：HK-2細胞接種到6孔板內(nèi)，細胞密度為90%時，用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagant將pcDNA3.1、pcDNA3.1-SIRT1轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)，培養(yǎng)1 d以后，用200 μg/ml的G418篩選2周，挑選抗性細胞擴大培養(yǎng)，經(jīng)缺氧復(fù)氧處理以后，分別記為pcDNA3.1+H/R組、pcDNA3.1-SIRT1+H/R組，用qRT-PCR和Western blot方法檢測細胞中SIRT1的表達變化。

1.2.2qRT-PCR檢測SIRT1表達變化 取HK-2細胞，用TRIZOL常規(guī)方法分別提取各組細胞中的RNA，RNA用DEPC水溶解，并經(jīng)紫外分光光度計檢測(OD260/OD280值在1.8～2.0之間)后，保存在-70℃。用Oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，體系為：0.5 μg RNA，2 μl的Random primer，8 μl reaction buffer，2 μl Ribo Lock RNase inhibitor(20 U/μl)，4 μl 10 mmol/L dNTP mix，2 μl的M-MLV。逆轉(zhuǎn)錄條件為：42℃，60 min；70℃，5 min。用SYBR Green qPCR試劑盒進行PCR擴增。體系為：7.0 μl的RNAse Free ddH2O，10 μl 2×SYBR Green solution，0.5 μl的上下游引物(10 μmol/L)，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl。PCR條件為：94℃ 5 min，94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 45 s,循環(huán)40次。根據(jù)相對定量方法分析SIRT1表達水平。SIRT1上游5′-TGAGTTGATTTCTGTGTATGAAGTT-3′，下游5′-ACACCTCGTCAAA-CTCCTC-3′。GAPDH上游5′-ACAACTTTGGTATC-GTGGAAGG-3′，下游5′-GCCATCACGCCACAGT-TTC-3′。

1.2.3Western blot檢測SIRT1表達變化 取HK-2細胞，將培養(yǎng)液吸除以后，添加細胞裂解液，置于冰上孵育20 min，12 000 r/min，4℃離心10 min。蛋白用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定濃度以后，保存在-20℃。取適量的蛋白樣品加入1/4體積的5×Loading buffer中，在100℃煮沸3 min。按照每個SDS-PAGE凝膠的泳道中添加40 μg樣品蛋白，SDS-PAGE凝膠為5%濃縮膠和10%分離膠。首先用80 V電壓電泳，蛋白成為一條直線以后，把電壓更換成120 V，染料進入到底部邊緣以后，關(guān)閉電源。將凝膠取出后，自來水洗滌，以100 V電壓把凝膠上的蛋白在4℃中轉(zhuǎn)移到NC膜上，轉(zhuǎn)膜時間約為90 min。NC膜放在5%脫脂奶粉中孵育60 min，然后再放在SIRT1抗體稀釋液中，SIRTI抗體以1∶200稀釋，置于4℃反應(yīng)10 h。取出NC膜，放在1∶4 000 稀釋后的二抗中，室溫孵育60 min，用ECL法顯色以后，內(nèi)參為GAPDH，分析條帶的光密度值，計算SIRT1蛋白水平。

1.2.4ELISA法檢測細胞分泌TNF-α、IL-1β的水平 Control、H/R、pcDNA3.1+H/R、pcDNA3.1-SIRT1+H/R組細胞按照上述方法處理后，取細胞培養(yǎng)液上清，用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β水平，步驟同試劑盒說明書，簡述如下：將標準品配制成10 ng/ml 的溶液，標準管共8管，在第1管中添加900 μl的標準品稀釋液，在第2～8管中加入500 μl 的標本稀釋液。同時在第1管中添加100 μl的10 ng/ml 標準品溶液混合后，取出500 μl添加至第2管中，按照上述方法對數(shù)稀釋，最后從第7管中取出500 μl棄掉，將第8管設(shè)置為空白對照。在每個孔中加入100 μl的標準品或者是待測樣品，在37℃反應(yīng)2 h，用洗滌液將反應(yīng)板洗滌4次以后，倒置于濾紙上印干。加入100 μl的第1抗體工作液，在37℃孵育1 h。洗滌液洗滌以后，添加100 μl酶標抗體工作液，在37℃反應(yīng)0.5h，用洗滌液將反應(yīng)板洗滌4次以后，加入100 μl的底物工作液，在37℃反應(yīng)15 min，添加終止液100 μl，在0.5 h內(nèi)用酶標儀檢測波長450 nm的吸光值。以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，根據(jù)標準曲線得出TNF-α、IL-1β的含量。

1.2.5Western blot檢測CHOP、Caspase-11蛋白水平 Control、H/R、pcDNA3.1+H/R、pcDNA3.1-SIRT1+H/R組細胞按照上述方法處理后，用Western blot方法檢測細胞中CHOP(抗體以1∶600稀釋)、Caspase-11(抗體以1∶100稀釋)蛋白水平，步驟同上。

1.2.6全自動生化分析儀檢測LDH含量 Control、H/R、pcDNA3.1+H/R、pcDNA3.1-SIRT1+H/R組細胞按照上述方法處理后，取培養(yǎng)液上清，常規(guī)方法用全自動生化分析儀檢測LDH水平。

2 結(jié)果

2.1缺氧復(fù)氧降低腎小管上皮細胞中SIRT1的表達水平 與Control組比較，H/R組細胞中SIRT1 mRNA和蛋白水平均明顯減少(P<0.05)，見圖1和表1。缺氧復(fù)氧降低腎小管上皮細胞中SIRT1的表達水平。

2.2pcDNA3.1-SIRT1明顯提高缺氧復(fù)氧條件下腎小管上皮細胞中SIRT1的表達水平 與H/R組比較，pcDNA3.1-SIRT1+H/R組細胞中SIRT1 mRNA和蛋白水平均明顯升高(P<0.05)，pcDNA3.1組細胞中SIRT1 mRNA和蛋白水平?jīng)]有變化，見圖2和表2。pcDNA3.1-SIRT1可顯著提高缺氧復(fù)氧腎小管上皮細胞中SIRT1的表達水平。

圖1 Western blot檢測缺氧復(fù)氧對腎小管上皮細胞中SIRT1蛋白水平影響Fig.1 Effect of hypoxia and reoxygenation on level of SIRT1 protein in renal tubular epithelial cells detected by Western blot

2.3SIRT1過表達可以明顯抑制缺氧復(fù)氧腎小管上皮細胞分泌TNF-α、IL-1β 與Control組比較，H/R組細胞培養(yǎng)液中的TNF-α、IL-1β含量明顯升高(P<0.05)。與H/R組比較，pcDNA3.1-SIRT1+H/R組細胞培養(yǎng)液中的TNF-α、IL-1β含量均明顯降低(P<0.05)，pcDNA3.1組細胞培養(yǎng)液中的TNF-α、IL-1β含量沒有變化，見表3。SIRT1過表達可顯著減少缺氧復(fù)氧腎小管上皮細胞分泌TNF-α、IL-1β。

GroupsSIRT1 mRNASIRT1 proteinControl1.00±0.000.63±0.05H/R0.36±0.051)0.24±0.031)t22.17011.585P0.0000.000

Note：Compared with control,1)P<0.05.

圖2 Western blot測定細胞轉(zhuǎn)染后缺氧復(fù)氧腎小管上皮細胞中SIRT1蛋白表達水平Fig.2 Western blot was used to detect expression level of SIRT1 protein in anoxia reoxygenation renal tubular epithelial cells after transfection

Tab.2 Expression of SIRT1 in anoxia reoxygenation renal tubular epithelial cells after transfection

GroupsSIRT1 mRNASIRT1 proteinH/R1.00±0.000.20±0.01pcDNA3.1+H/R0.99±0.101)0.19±0.031)pcDNA3.1-SIRT1+H/R1.96±0.182)0.34±0.062)F65.89413.761P0.0000.006

Note：Compared with H/R,1)P>0.05;compared with H/R,2)P<0.05.

GroupsTNF-α(ng/ml)IL-1β(pg/ml)Control0.35±0.046.23±0.52H/R0.95±0.081)13.01±1.581)pcDNA3.1+H/R0.96±0.062)12.54±1.732)pcDNA3.1-SIRT1+H/R0.74±0.053)9.56±1.043)F69.27714.541P0.0000.001

Note：Compared with control,1)P<0.05;compared with H/R,2)P>0.05;compared with H/R,3)P<0.05.

圖3 Western blot檢測過表達SIRT1的腎小管上皮細胞經(jīng)缺氧復(fù)氧處理后CHOP、Caspase-11蛋白水平變化Fig.3 Changes of CHOP and Caspase-11 protein levels in renal tubular epithelial cells after overexpression of SIRT1 detected by Western blot

2.4SIRT1過表達可以明顯降低腎小管上皮細胞中CHOP、Caspase-11蛋白水平 與Control組比較，H/R組細胞中CHOP、Caspase-11蛋白水平明顯升高(P<0.05)。與H/R組比較，pcDNA3.1-SIRT1+H/R組細胞中CHOP、Caspase-11蛋白水平均明顯降低(P<0.05)，pcDNA3.1組細胞中CHOP、Caspase-11蛋白水平?jīng)]有變化，見圖3和表4。SIRT1過表達顯著抑制缺氧復(fù)氧腎小管上皮細胞中CHOP、Caspase-11蛋白表達。

2.5SIRT1過表達可以降低腎小管上皮細胞培養(yǎng)液中的LDH水平 與Control組比較，H/R組細胞培養(yǎng)液中LDH水平明顯升高(P<0.05)。與H/R組比較，pcDNA3.1-SIRT1+H/R組細胞培養(yǎng)液中LDH水平明顯降低(P<0.05)，pcDNA3.1組細胞培養(yǎng)液中LDH水平?jīng)]有變化，見表5。SIRT1過表達顯著減輕缺氧復(fù)氧腎小管上皮細胞損傷。

GroupsCHOPCaspase-11Control0.13±0.020.17±0.03H/R0.38±0.021)0.56±0.081)pcDNA3.1+H/R0.39±0.052)0.58±0.062)pcDNA3.1-SIRT1+H/R0.21±0.013)0.32±0.033)F28.20639.686P0.0000.000

Note：Compared with control,1)P<0.05;compared with H/R,2)P>0.05;compared with H/R,3)P<0.05.

GroupsLDH(U/L)Control21.05±1.63H/R38.56±2.181)pcDNA3.1+H/R37.46±4.592)pcDNA3.1-SIRT1+H/R28.59±1.463)F26.529P0.000

Note：Compared with control,1)P<0.05;compared with H/R,2)P>0.05;compared with H/R,3)P<0.05.

3 討論

腎組織損傷的發(fā)生與腎組織中的炎癥反應(yīng)有關(guān)，目前對于腎組織損傷的發(fā)生機制尚不清楚，腎小管上皮細胞作為腎組織損傷的敏感細胞具有分泌炎癥因子等作用[10]。缺氧復(fù)氧是腎組織損傷發(fā)生的常見誘因，在這一過程中，腎小管上皮細胞合成和分泌的炎癥因子是腎組織炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要原因，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)腎小管上皮細胞分泌炎癥因子，這些炎癥因子又可以反過來刺激腎小管上皮細胞，引起細胞損傷，導(dǎo)致存在于細胞內(nèi)的LDH進入細胞外[11,12]。本實驗的結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧后的腎小管上皮細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β水平升高，同時細胞培養(yǎng)液中的LDH水平也升高，提示成功構(gòu)建了缺氧復(fù)氧腎小管上皮細胞損傷模型。

SIRT1基因由500個氨基酸殘基構(gòu)成，其5′端和3′端分別為含有兩個大小53 bp和1 793 bp的非編碼區(qū)域，其編碼的蛋白質(zhì)是一個無序蛋白，含有一個Rossmann折疊而成的結(jié)構(gòu)域和鋅帶結(jié)構(gòu)、螺旋結(jié)構(gòu)組成的結(jié)構(gòu)域，底物可以通過結(jié)合于鋅帶結(jié)構(gòu)、螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生催化反應(yīng)[13-15]。SIRT1具有多種生物學(xué)功能，例如：能量代謝、神經(jīng)系統(tǒng)功能維持、應(yīng)激反應(yīng)等，在心肌組織、腎臟等組織中廣泛表達[16]。SIRT1參與急性腎損傷過程，其具有抑制缺氧復(fù)氧、TGF-β1、高糖等誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡的作用，對于腎組織纖維化、腎小管上皮細胞EMT等均有抵抗作用[17-20]。研究表明，SIRT1還具有抗炎功能，目前在血管組織炎癥、氣道炎癥、脊髓炎癥中均已證實[21]。本實驗表明，SIRT1高表達的腎小管上皮細胞經(jīng)缺氧復(fù)氧處理后，細胞分泌的TNF-α、IL-1β減少，細胞培養(yǎng)液中的LDH水平也降低，SIRT1具有減輕腎小管上皮細胞炎性損傷的作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是存在于細胞內(nèi)的最大細胞器，其可以維持細胞穩(wěn)態(tài)，當受到某些因素刺激以后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)原來的正常生理功能發(fā)生紊亂，導(dǎo)致鈣離子穩(wěn)態(tài)平衡被破壞，折疊錯誤和未折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[22]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與腎組織損傷有關(guān)，并且可以通過Caspase途徑參與腎小管炎癥反應(yīng)[23]。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的標志之一，其具有誘導(dǎo)IL-1β等炎癥因子產(chǎn)生的作用，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮促進作用[24]。IL-1β是炎癥反應(yīng)早期的前炎癥因子，炎性的Caspase可以通過剪切IL-1β前體進而促進IL-1β的成熟，是Caspase家族炎癥成員，其受到CHOP的正調(diào)控作用，在炎癥中發(fā)揮促進作用[25]。之前的研究表明，SIRT1具有下調(diào)軟骨細胞、心肌細胞等細胞中CHOP表達的作用，SIRT1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中發(fā)揮保護作用[26-28]。本實驗表明，高表達SIRT1后的腎小管上皮細胞中CHOP、Caspase-11蛋白表達水平降低，提示SIRT1可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激Caspase炎性途徑發(fā)揮抗腎小管上皮細胞炎性損傷的作用。

總而言之，SIRT1在腎小管上皮細胞缺氧復(fù)氧炎性損傷中發(fā)揮抑制作用，其作用機制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的Caspase炎性反應(yīng)有關(guān)，這對于以后研究急性腎損傷發(fā)病機制具有重要意義，我們將在以后的實驗中對SIRT1在腎小管上皮細胞炎性損傷中的作用進行驗證和具體機制探討。