王海斌 石利濤

(1遵化市人民醫(yī)院骨科，河北 遵化 064200；2承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科)

髖骨骨折患者中大多數(shù)為老年患者，通常首選手術(shù)治療〔1，2〕，但預后并不理想。有報道顯示，老年髖骨骨折患者手術(shù)后死亡率高達30%〔3，4〕。調(diào)查研究表明，老年髖骨骨折術(shù)后死亡危險因素中臥床時間不是獨立危險因素，死亡的主因是骨折引起的肺部并發(fā)癥〔5〕，而目前對于這種情況缺乏有效治療手段。

骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是骨髓中具有多向分化潛力和自我更新能力的干細胞，在一定條件下可向3個胚層的細胞分化〔6〕，其多向分化潛能會促進組織再生，如肌肉、軟骨、脂肪等組織〔7〕。同時，由于BMSCs自身增殖能力強、分化廣，還具有免疫調(diào)節(jié)及修復受損組織等功能。當發(fā)生肺部炎癥時，BMSCs向肺部聚集，參與肺組織的功能修復。但是，當老年患者發(fā)生髖骨骨折并發(fā)肺損傷時，BMSCs是否也能起到相似作用尚不清楚。本研究以移植BMSCs進行干預治療，觀察髖骨骨折后急性肺損傷的病理變化，探討B(tài)MSCs治療髖骨骨折并發(fā)肺損傷的可能機制。

1 材料和方法

1.1分組和建模 45只健康雄性SD老年大鼠(10月齡)，實驗動物許可證號：SCXK(冀)2015-0100，由河北省實驗動物中心提供。本研究通過遵化市人民醫(yī)院倫理委員會審查；所有大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實驗，隨機分成正常組(無任何處理)、模型組、治療組，每組15只。

建模方法：大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，打擊器上仰臥固定，左下肢置于砧板上拉直與水平面平行，標記大鼠左側(cè)大粗隆位置，然后緊貼粗隆間放置打擊器鈍骨刀，使砝碼從20 cm處落下，造成左側(cè)髖骨骨折〔8〕。檢測觸及骨擦感和骨擦音被認為造模成功。模型組建立髖骨骨折模型后尾靜脈注射1 ml生理鹽水，治療組建立髖骨骨折模型后尾靜脈注射1 ml BMSCs(2.5×106/ml)。

1.2主要試劑與儀器 倒置顯微鏡(Olympus公司)，骨折打擊器(自制)，組織勻漿機(上海天呈科技有限公司北京分公司)，切片機(德國Leica公司)；流式細胞儀(德國Partec)；PE-CD90抗體、PE-CD45抗體、FITC-CD44抗體(美國e-BIOSCIENCE)；低溫高速離心機(Eppendorf 公司)，大鼠髓過氧化物酶(MPO)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(R&D 公司)；Toll樣受體(TLR)9多克隆抗體、核因子(NF)-κB多克隆抗體(購自abcam公司)。

1.3大鼠BMSCs的分離培養(yǎng) 采用脫臼法處死SD大鼠(1月齡，河北省實驗動物中心提供)，離斷后肢轉(zhuǎn)移至無菌平皿中，去除附著肌肉，剪除股骨末端，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗髓腔收集骨髓。反復吹打成骨髓單細胞懸液，轉(zhuǎn)移到離心管中，離心5 min，棄上清，DMEM培養(yǎng)液重懸，按1×105/cm2密度接種于培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中孵育培養(yǎng)，每周換液3次，待細胞達到80%～90%融合時，進行消化，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.4BMSCs的鑒定 第三代BMSCs清洗、消化后，1 000 r/min離心5 min收集細胞，用PBS重懸，將細胞濃度調(diào)節(jié)為1×1012/L單細胞懸液；流式細胞儀進行檢測：將單細胞懸液轉(zhuǎn)移至取液管中，分別加入FITC-CD44、PE-CD90和PE-CD45一抗，充分混勻，離心3 000 r/min，37℃避光孵育，過濾后進行檢測。

1.5肺組織損傷評分 建模后24 h，每組隨機取5只大鼠，4%多聚甲醛固定24 h，梯度脫水，二甲苯透明后石蠟包埋固定，連續(xù)切片(厚度5 μm)。切片常規(guī)脫蠟、復水，行蘇木精-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)并拍照。對肺組織損傷進行評分，每項標準按無、輕、中、重，分別記為 0、1、2、3 分。評分標準：(1)肺不張；(2)肺泡出血；(3)肺泡水腫；(4)炎癥細胞浸潤；(5)透明膜形成；(6)肺間質(zhì)水腫。高倍顯微鏡下每張切片隨機取5個視野，取平均值即得肺組織損傷評分。

1.6肺組織干濕質(zhì)量比(W/D) 取大鼠右肺中葉組織稱重，然后放入60℃恒溫烤箱中3 d至恒重再稱重，兩次稱重之比為W/D值。

1.7肺組織中MPO及炎性因子TNF-α、IL-6水平 每組取5只大鼠肺組織各100 mg，研碎后4℃下加裂解緩沖液裂解1 h，離心10 min取上清液，按照ELISA 試劑盒說明步驟操作。

1.8ELISA 檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6水平 每組取5只大鼠，經(jīng)腹主動脈取血5 ml，靜置，離心10 min取血清，按照ELISA 試劑盒說明步驟操作。

1.9Western印跡法檢測肺組織中TLR9、NF-κB蛋白水平 在肺組織(50 mg)中加1 ml裂解液，冰上勻漿，4℃離心10 min，經(jīng)BCA法蛋白定量后上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)：制備5%濃縮膠及12%的分離膠。電泳：調(diào)解電壓至80 V，90 min后轉(zhuǎn)為100 V至溴酚藍跑至距分離膠底部0.5 cm時停止。轉(zhuǎn)膜：280 mA恒流1 h，結(jié)束后關(guān)閉電源取出聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在麗春紅染液中浸泡10 min，如有條帶顯現(xiàn)說明轉(zhuǎn)膜成功，采用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉1.5 h。加一抗、β-actin(1∶2 000)，4℃冰箱過夜。加二抗37℃ 2 h，結(jié)束后用TBST漂洗10 min×3次，后顯影。用 Quantity One軟件對蛋白質(zhì)條帶進行分析，測定其吸光度值。目的蛋白的相對表達強度=目的蛋白的吸光度值/β-actin的吸光度值。

1.10統(tǒng)計學方法 采用 SPSS17.0 軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs的形態(tài) BMSCs接種后6～8 h，懸浮的細胞開始貼壁，24 h貼壁基本完成；3 d后呈梭形或多角形；7 d后貼壁細胞達80%～90%融合，整體呈螺旋形或漩渦狀(圖1)。

2.2BMSCs表面標志物檢測 P3代大鼠BMSCs呈CD44+/CD90+/ CD45-，鑒定結(jié)果確認為BMSCs，見圖2。

2.3肺組織病理學改變 正常組管壁無增厚，肺泡結(jié)構(gòu)正常，未發(fā)現(xiàn)炎性細胞浸潤；模型組大鼠肺泡和間質(zhì)處發(fā)現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤，同時肺泡間隔增厚，肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞；治療組大鼠肺泡壁結(jié)構(gòu)比較完整，肺泡和間質(zhì)處炎性改變減輕。見圖3。正常組肺組織損傷評分為(2.75±1.03)分，明顯低于模型組(7.42±1.55)分及治療組(5.80±1.34)分，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)；治療組肺組織損傷評分也明顯低于模型組(P<0.01)。

圖2 流式細胞儀檢測BMSCs的表面標志物

圖3 各組肺組織HE染色(×100)

2.4各組肺組織W/D 模型組肺組織W/D(6.50±0.51)明顯高于正常組(3.90±0.38)和治療組(4.70±0.44，均P<0.05)，治療組W/D并未恢復到正常水平。

2.5ELISA檢測肺組織中 MPO 及TNF-α、IL-6水平 模型組肺組織中MPO及TNF-α、IL-6水平明顯高于正常組(P<0.01)，而與模型組相比，治療組肺組織中 MPO、TNF-α、IL-6水平明顯下降(P<0.01)。見表1。

表1 各組肺組織MPO、TNF-α和IL-6水平

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；下表同

2.6各組血清TNF-α、IL-6水平比較 模型組血清中TNF-α、IL-6水平較正常組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而治療組血清中TNF-α、IL-10水平較模型組明顯下降(P<0.01)，見表2。

2.7Western印跡檢測結(jié)果 模型組肺組織中TLR9(0.87±0.16)、NF-κB(1.10±0.14)蛋白表達水平較正常組(0.25±0.07，0.22±0.08)和治療組(0.58±0.14，0.65±0.16)明顯升高(P<0.01)；與正常組相比，治療組TLR9、NF-κB蛋白表達水平更高(P<0.01)。見圖4。

表2 各組血清中TNF-α、IL-6水平比較

圖4 Western印跡檢測各組肺組織中TLR9、NF-κB蛋白表達水平

3 討 論

髖骨骨折是老年患者常見的骨科疾病，也是其致殘、致死原因之一〔9〕。近年來，老齡化情況日益嚴重，老年人骨質(zhì)量及強度大幅下降，易發(fā)生骨質(zhì)疏松，摔倒等一些低能量損傷即可導致髖骨骨折，這對老年人生活、生存質(zhì)量造成嚴重威脅〔10〕。有報道顯示，老年患者發(fā)生髖骨骨折后1年內(nèi)病死率高達30%，其中許多患者不能恢復至骨折前水平〔11〕。造成死亡率高的原因目前尚不清楚，也缺乏有效治療手段〔12〕。

BMSCs是可進行體外培養(yǎng)的干細胞，在不同環(huán)境刺激下能參與組織再生、細胞分化〔13〕。同時，在不同周圍組織細胞和微環(huán)境的誘導下，BMSCs能參與免疫抑制過程，表達可溶性因子如趨化因子-2、白血病抑制因子等〔14，15〕。經(jīng)尾靜脈注射的 BMSCs可在體內(nèi)廣泛分布，但依然有傾向性，會優(yōu)先向受損、發(fā)炎組織遷移。BMSCs表面的抗原并不具有特異性，因此在BMSCs上并未發(fā)現(xiàn)特異性標記分子〔16〕。所以，采用CD90、CD44陽性表達，CD45陰性表達來鑒定BMSCs〔17〕。本研究采用流式細胞儀檢測證明得到的細胞為BMSCs。

創(chuàng)傷可導致嚴重的炎癥反應(yīng)，會使炎癥細胞向肺部浸潤，而肺組織中也出現(xiàn)大量巨噬細胞〔18〕。老年大鼠髖部骨折后，肺部管腔分泌物明顯增多，出現(xiàn)大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤。經(jīng)尾靜脈注射BMSCs后，肺部分泌物、炎癥細胞浸潤減少，提示BMSCs可有效緩解髖部骨折所致急性肺部損害。TNF-α是由單核巨噬細胞產(chǎn)生的，在機體免疫調(diào)節(jié)、抗感染等方面發(fā)揮著重要的作用〔19〕，但TNF-α表達過高則會引起休克、發(fā)熱等反應(yīng)；IL-6是趨化因子家族中的細胞因子，能與其他細胞因子結(jié)合產(chǎn)生協(xié)同作用，參與機體發(fā)熱、炎癥反應(yīng)等，是機體炎癥狀態(tài)的指標之一〔20〕。本實驗結(jié)果提示，髖部骨折會導致老年大鼠出現(xiàn)急性肺損傷及全身炎性反應(yīng)，表現(xiàn)為外周血及肺內(nèi)TNF-α、IL-6水平升高；BMSCs可以通過平衡炎癥反應(yīng)達到減輕急性肺損傷的作用。

TLR被證實是一類識別型受體家族，在呼吸機相關(guān)性肺損傷(VALI)中起到重要作用。國外報道，在VALI研究中發(fā)現(xiàn)TLR家族中的TLR4和TLR9表達水平均明顯上調(diào)〔21〕。在急性肺損傷發(fā)生過程中，TLR被激活，同時活化NF-κB信號通路，而后者的活化可釋放炎性細胞因子，如IL-6和TNF-α等，促進炎癥反應(yīng)進一步發(fā)展〔22〕。本實驗結(jié)果顯示，BMSCs抑制了建模后大鼠肺組織中TLR9及NF-κB蛋白表達水平，同時肺組織和血清中TNF-α、IL-6含量明顯下降，提示BMSCs減輕了建模后的肺病理性損傷程度，這與有關(guān)文獻報道基本一致〔23〕。BMSCs移植能減輕大鼠肺損傷，降低炎性因子，可能成為急性呼吸窘迫綜合征和肺損傷的潛在細胞治療方法。

綜上所述，本實驗證實了髖骨骨折能夠?qū)Ψ尾吭斐杉毙該p傷，而通過尾靜脈途徑注射BMSCs能有效減輕骨折后急性期肺部炎癥及由此導致的肺損傷，從而為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)、實驗數(shù)據(jù)。