徐卓 張萌 張志磊 賈聿明 王超 彭利

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050011)

肝癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤之一，早期臨床癥狀不明顯，起病隱匿，進(jìn)展迅速，確診時(shí)大部分患者已處于晚期或已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且近些年我國(guó)的肝癌發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)〔1〕。腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力發(fā)揮重要作用。因此，尋找有效的肝癌治療途徑具有重要意義。帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解聯(lián)蛋白金屬蛋白酶(ADAMTS)9是ADAMTS家族成員之一，是該家族中結(jié)構(gòu)最為保守的成員，在乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因樣作用〔2，3〕。肝癌組織中ADAMTS9下調(diào)表達(dá)，與發(fā)生及預(yù)后有關(guān)〔4〕，ADAMTS 9啟動(dòng)子異常甲基化可能參與肝細(xì)胞癌的形成和進(jìn)展〔5〕，但關(guān)于ADAMTS9對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性影響尚未明確。去甲氧基姜黃素(DMC)是姜黃素的衍生物，已被證實(shí)有確切的抗腫瘤活性，且可減輕一些腫瘤致癌因素對(duì)機(jī)體造成的損傷，也可抑制腫瘤侵襲和遷移〔6〕。有研究顯示，DMC可抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移〔7〕。本研究旨在ADAMTS9過(guò)表達(dá)或DMC單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移及磷脂酰肌醇3-激酶/第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白/蛋白激酶B(PI3K/PTEN/AKT)信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Corning；胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)8購(gòu)自上海生工；去甲氧基姜黃素購(gòu)自上海皓元；Transwell小室試劑盒購(gòu)自美國(guó)Corning；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD；ADAMTS9、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、PI3K、PTEN和p-AKT抗體購(gòu)自美國(guó)CST；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad。

1.2細(xì)胞株 人正常肝細(xì)胞HL-7702、肝癌細(xì)胞系HepG2、人肝癌低轉(zhuǎn)移MHCC 97-L細(xì)胞及人肝癌高轉(zhuǎn)移MHCC97-H細(xì)胞系均購(gòu)自美國(guó)ATCC。細(xì)胞在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于5%體積分?jǐn)?shù)二氧化碳(CO2)、飽和濕度的培養(yǎng)箱中37℃恒溫傳代培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞中ADAMTS9表達(dá)檢測(cè) 采用Western印跡法。細(xì)胞中加適量裂解液于冰上裂解反應(yīng)30 min，Bradford法定量蛋白。蛋白樣品在100℃水浴中變性5 min，加適量上樣緩沖液，每孔道上樣30 μg，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，經(jīng)100 V濕轉(zhuǎn)1.5 h，轉(zhuǎn)膜完成后用5%的脫脂奶粉封閉膜1～2 h，加一抗(1∶500稀釋的ADAMTS9抗體)，4℃冰箱中過(guò)夜，加1∶1 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u晃1～2 h，洗滌。暗室中壓上X線(xiàn)片，采用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，曝光約60 s，即刻進(jìn)行顯影、洗片，掃描儀進(jìn)行掃描并測(cè)定。Quantity軟件分析ADAMTS9蛋白與內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)灰度值，以其比值作為各個(gè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4實(shí)驗(yàn)分組及處理 MHCC97-H細(xì)胞分為4個(gè)處理組，即對(duì)照組、pcDNA3.1-ADAMTS9組、DMC和pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC組。對(duì)照組細(xì)胞不經(jīng)特殊處理。pcDNA3.1-ADAMTS9組轉(zhuǎn)染ADAMTS9的過(guò)表達(dá)載體48 h，轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明。DMC組使用40 μmol/L DMC處理細(xì)胞48 h。pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC組用pcDNA3.1-ADAMTS9及40 μmol/L DMC共同處理細(xì)胞48 h。

1.5細(xì)胞活力檢測(cè) 采用CCK8法。以5×103/孔接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的MHCC97-H細(xì)胞于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，按照1.4分組處理，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，收集處理至規(guī)定時(shí)間的細(xì)胞，每孔中加入10 μl的CCK8溶液，培養(yǎng)箱孵育2 h，于450 nm，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)分組及處理同上。Transwell小室置于24孔培養(yǎng)板，形成上、下兩室。上室面均勻鋪上50 μl由不含血清培養(yǎng)基稀釋的Matrigel，置于37℃培養(yǎng)箱中。將處理至規(guī)定時(shí)間的4組細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×105/ml，每個(gè)上室中加入細(xì)胞懸液100 μl，下室中加入含10%FBS的培養(yǎng)液500 μl，于37℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。棉簽輕輕拭去上室面的細(xì)胞，依次經(jīng)4%多聚甲醛固定、0.1%結(jié)晶紫染色后，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野下(×200)侵襲至濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)，取均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。除了未鋪Matrigel，其他步驟同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.8PCNA、MMP-2、MMP-9、PI3K、PTEN和p-AKT蛋白表達(dá)檢測(cè) 方法同1.3。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1ADAMTS9在肝癌細(xì)胞表達(dá) 肝癌HepG2、MHCC97-L和MHCC97-H細(xì)胞中ADAMTS9表達(dá)(0.204±0.021、0.165±0.018、0.074±0.010)均有不同程度的降低，與正常肝細(xì)胞HL-7702(0.602±0.056)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=163.674，P=0.000)。見(jiàn)圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)肝癌細(xì)胞ADAMTS9蛋白表達(dá)

2.2pcDNA3.1-ADAMTS9轉(zhuǎn)染MHCC97-H細(xì)胞效果 pcDNA3.1-ADAMTS9組ADAMTS9的蛋白表達(dá)(0.625±0.059)顯著高于對(duì)照組(0.088±0.010，P<0.05)，而pcDNA3.1組ADAMTS9的蛋白表達(dá)(0.096±0.012)與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 pcDNA3.1-ADAMTS9轉(zhuǎn)染MHCC97-H細(xì)胞后ADAMTS9的蛋白表達(dá)

2.3過(guò)表達(dá)ADAMTS9或DMC對(duì)MHCC97-H細(xì)胞活力的影響 pcDNA3.1-ADAMTS9和DMC組MHCC97-H細(xì)胞活力(0.541±0.048、0.482±0.043)顯著低于對(duì)照組(0.754±0.065，P<0.05)，而pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC組對(duì)細(xì)胞活力抑制更明顯(0.312±0.030)，且顯著高于pcDNA3.1-ADAMTS9和DMC組(P<0.05)。

2.4過(guò)表達(dá)ADAMTS9或DMC對(duì)MHCC97-H細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響 pcDNA3.1-ADAMTS9組和DMC組細(xì)胞侵襲及遷移數(shù)均顯著低于對(duì)照組，而pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC組細(xì)胞侵襲及遷移數(shù)均顯著低于pcDNA3.1-ADAMTS9組和DMC組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.5過(guò)表達(dá)ADAMTS9或DMC對(duì)MHCC97-H細(xì)胞增殖及侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 pcDNA3.1-ADAMTS9組和DMC組細(xì)胞PCNA、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)均顯著低于對(duì)照組，而pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC組細(xì)胞PCNA、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)均顯著低于pcDNA3.1-ADAMTS9組和DMC組(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表2。

表1 過(guò)表達(dá)ADAMTS9或DMC對(duì)MHCC97-H細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC組比較：2)P<0.05，下表同

圖3 Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞 PCNA、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)

表2 PCNA、MMP-2和MMP-9的蛋白相對(duì)表達(dá)比較

2.6過(guò)表達(dá)ADAMTS9或DMC對(duì)MHCC97-H細(xì)胞PI3K/PTEN/AKT信號(hào)的影響 pcDNA3.1-ADAMTS9組和DMC組細(xì)胞PI3K和p-AKT的蛋白表達(dá)均顯著低于對(duì)照組，PTEN的蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC組細(xì)胞PI3K和p-AKT的蛋白表達(dá)均顯著低于pcDNA3.1-ADAMTS9組和DMC組，PTEN的蛋白表達(dá)均顯著高于pcDNA3.1-ADAMTS9組和DMC組(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表3。

圖4 Western印跡檢測(cè)PI3K、PTEN和p-AKT的蛋白表達(dá)

表3 PI3K、PTEN和p-AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)比較

3 討 論

ADAMTS9在血管內(nèi)皮、心臟、卵巢等組織中有廣泛表達(dá)，定位于3p14.2-p14.3染色體，已有研究報(bào)道該區(qū)域在鼻咽癌、食管鱗癌等多種腫瘤中缺失〔8〕。乳腺癌中ADAMTS9的上調(diào)表達(dá)可抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移〔9〕；外源性的ADAMTS9表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移，阻滯細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)可抑制AKT信號(hào)通路〔10〕。這提示ADAMTS9是一個(gè)重要的抑癌基因，其可能在肝癌中發(fā)揮重要作用。本研究首先檢測(cè)了肝癌細(xì)胞ADAMTS9表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞ADAMTS9均為低表達(dá)，在肝癌高轉(zhuǎn)移MHCC97-H細(xì)胞表達(dá)最低，因此選擇作為研究對(duì)象。

DMC為姜黃素的衍生物，具有抗纖維化、抗氧化、抗炎、抗癌等作用，其抗癌機(jī)制受到廣泛關(guān)注〔11〕。有研究發(fā)現(xiàn)，DMC可抑制多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，如肺癌、肝癌、白血病等，且抗癌譜較廣，毒副作用小〔12，13〕。作為抗癌新藥，具有很好的應(yīng)用前景。本研究結(jié)果提示ADAMTS9和DMC聯(lián)合可能是一種新的肝癌治療途徑。

腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤臨床治療的一個(gè)棘手難題。已有研究顯示DMC抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制與降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水解酶有關(guān)〔14〕。MMP-2和MMP-9是MMPs家族成員之一，可特異性降解Ⅳ型膠原，肝癌中抑制MMP-2和MMP-9表達(dá)可降低癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力〔15〕。PCNA為一種核蛋白，在細(xì)胞周期S期有廣泛表達(dá)，其表達(dá)程度可反映細(xì)胞的增殖能力，目前已在多種惡性腫瘤增殖活性檢測(cè)中有廣泛應(yīng)用〔16〕。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)ADAMTS9及DMC均可下調(diào)PCNA、MMP-2和MMP-9表達(dá)，聯(lián)合對(duì)PCNA、MMP-2和MMP-9表達(dá)抑制更明顯。

PI3K/AKT信號(hào)在多種人類(lèi)腫瘤中表達(dá)失調(diào)，AKT被PI3K磷酸化激活后可促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，抑制細(xì)胞凋亡，是該通路的效應(yīng)核心〔17〕。PTEN是一種重要的抑癌基因，可負(fù)反饋調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)，其表達(dá)缺失可引起腫瘤進(jìn)展、預(yù)后不良和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移〔18〕。PTEN能使PI3K去磷酸化，失去對(duì)AKT的激活，從而抑制PI3K/AKT信號(hào)，因此大多數(shù)學(xué)者稱(chēng)之為PI3K/PTEN/AKT信號(hào)通路〔19〕。有研究顯示，羅格列酮可通過(guò)PI3K/PTEN/AKT通路抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖〔20〕。ADAMTS9可通過(guò)抑制AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路在胃癌中發(fā)揮功能性腫瘤抑制作用〔21〕。本研究結(jié)果提示ADAMTS9或DMC對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲遷移的影響與PI3K/PTEN/AKT信號(hào)有關(guān)。

綜上，過(guò)表達(dá)ADAMTS9及DMC均可抑制肝癌細(xì)胞活力、侵襲和遷移能力，兩者聯(lián)用對(duì)細(xì)胞抑制作用更明顯，機(jī)制可能與下調(diào)PCNA、MMP-2和MMP-9及PI3K/PTEN/AKT信號(hào)通路有關(guān)。本研究提示過(guò)表達(dá)ADAMTS9及過(guò)表達(dá)ADAMTS9和DMC聯(lián)合可能是肝癌治療的新的途徑。但本研究?jī)?nèi)容有限，還需更多的體內(nèi)、體外及臨床研究證實(shí)。