張翠翠，馬亞丹，李林杰，龐凌云，詹麗娟*

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

衰老黃化是限制當(dāng)前采后西蘭花貯運(yùn)與銷售的主要因素。鮮切西蘭花由于在微加工操作（切割、清洗、包裝等）中遭受機(jī)械傷害，使得較完整花球更易發(fā)生衰老黃化，主要表現(xiàn)為花蕾開裂、松散、褪綠黃化甚至腐爛等癥狀，嚴(yán)重影響其感官質(zhì)量、營養(yǎng)品質(zhì)和商品價值。為此，國內(nèi)外學(xué)者采用物理、化學(xué)和生物方法對西蘭花進(jìn)行保鮮[1]，盡管這些方法都取得了良好的保鮮效果，但也存在成本較高、有毒害物質(zhì)殘留、對環(huán)境不友好等不足之處，尤其是化學(xué)物質(zhì)如亞硫酸鹽已經(jīng)被禁止在鮮切果蔬中使用[2]，其不能滿足當(dāng)前消費者對廉價安全、綠色環(huán)保型食品的需求。因此，尋求開發(fā)低廉有效、綠色安全的保鮮方法迫在眉睫。

最新研究表明，熒光照射（光照）處理作為一種新興的非熱物理保鮮方法已經(jīng)被證實能夠延緩果蔬采后衰老，維持果蔬貯藏品質(zhì)[3]，而且和其他保鮮方法相比，光照處理具有來源廣泛、成本低廉、無毒害和副產(chǎn)物殘留、對環(huán)境友好等優(yōu)點[3-4]，完全符合當(dāng)前國內(nèi)外倡導(dǎo)的綠色、安全、節(jié)能和環(huán)境友好型保鮮技術(shù)要求。鮮切果蔬采后加工與銷售過程一般都在室內(nèi)進(jìn)行，不可避免受到室內(nèi)光照（主要是熒光燈照射）的影響，盡管如此，目前國內(nèi)外對光照技術(shù)在果蔬保鮮中的應(yīng)用研究還處于探索階段，主要集中于研究光照強(qiáng)度和周期對果蔬采后營養(yǎng)品質(zhì)和生理變化的影響[5-9]，而對光照保鮮果蔬作用機(jī)制知之甚少。早期研究認(rèn)為光照延緩衰老與光合作用產(chǎn)生的糖類物質(zhì)有關(guān)[10]，該觀點最近也在對芹菜[6]、生菜[7]、中國芥藍(lán)[11]、菠菜[12]等的大量研究中被證實。這些研究發(fā)現(xiàn)采后綠色蔬菜類在合適的光照條件下能夠繼續(xù)進(jìn)行光合作用，積累如可溶性糖等光合產(chǎn)物，補(bǔ)充因呼吸消耗的營養(yǎng)物質(zhì)，從而延緩衰老進(jìn)程。

前期研究發(fā)現(xiàn)，24 μmol/（m2gs）光照處理能夠延緩鮮切西蘭花衰老，維持其貯藏品質(zhì)[8-9]，但機(jī)制不詳。為了進(jìn)一步探索光照對采后果蔬的保鮮機(jī)制，本實驗在前期的研究基礎(chǔ)上，從可溶性糖累積的角度解析光照對鮮切西蘭花衰老黃化的調(diào)控作用。分別研究光照處理對鮮切西蘭花衰老黃化和可溶性糖變化的影響，并采用葡萄糖溶液對鮮切西蘭花進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)一步探討可溶性糖在鮮切西蘭花衰老黃化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮西蘭花（Brassica oleracea L.）購于丹尼斯超市，挑選無病蟲害、成熟度和大小一致的花球，清洗后瀝干水分，用鋒利的刀具將其切分成帶有2 cm莖的小花球（每個小花球質(zhì)量約9 g），切分過程中盡可能保持小花球的完整度。切分后的小花球洗凈瀝干備用。

丙酮、NaOH 生工生物工程（上海）股份有限公司；葡萄糖、蔗糖、果糖 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-3000離子色譜儀 美國Dionex公司；光照培養(yǎng)室鄭州興瑞制冷設(shè)備有限公司定制；T8熒光燈 佛山電器照明有限公司；752型紫外-可見分光光度計 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將西藍(lán)花分別采用光照處理（實驗1）和葡萄糖溶液處理（實驗2），各處理方法如下。

光照處理：約200 g花球單層置于塑料托盤內(nèi)（花蕾向上），然后將托盤放入聚乙烯袋內(nèi)熱封口，封口后的樣品放入光照培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行光照培養(yǎng)處理。光照條件的設(shè)置參考本課題組前期方法[9]，通過調(diào)整熒光燈到樣品的距離，使到達(dá)樣品表面的光照強(qiáng)度為2 4 μ m o l/（m2g s） ， 光 照 周 期 為1 2 h/d（9∶00ü21∶00），以黑暗條件為對照，貯藏溫度為7 ℃，分別在貯藏前（0 d）和貯藏后的第1天和第5天取樣分析測定黃化指數(shù)、葉綠素含量和可溶性糖含量。

葡萄糖溶液處理：將大小合適的泡沫板蓋在塑料托盤上，在泡沫板上按照花球莖的尺寸挖孔，把花球花蕾向上插入孔中，使其豎立固定在泡沫板上（每盤放置15～20 個花球），然后向托盤內(nèi)分別注入20、40、60、80、120、160 mmol/L葡萄糖溶液直至浸沒花球莖下端0.5 cm處，最后將托盤放入聚乙烯袋熱封口，封口后的樣品放入7 ℃培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)，每24 h更換新鮮葡萄糖溶液，以去離子水為對照，在培養(yǎng)后的第5天取樣分析測定黃化指數(shù)和葡萄糖含量。

1.3.2 指標(biāo)測定

1.3.2.1 黃化指數(shù)的測定

黃化級別的判斷及指數(shù)的計算參照文獻(xiàn)[8-9]。黃化級別分為5 級：0級樣品為深綠色，顏色一致，無黃化；1級樣品為綠色，點黃化（每個大花球上約有2～3 處黃點，每個黃點有3～4 個小花蕾變黃）面積之和小于總花蕾面積的1/10；2級樣品為輕微黃化，點黃化面積占比在1/10～1/5之間；3級樣品為中度黃化，點黃化面積占比在1/5～1/4之間；4級樣品為中度-嚴(yán)重黃化，點黃化面積占比在1/4～1/2之間；5級樣品為嚴(yán)重黃化，點黃化面積占比大于1/2；每個級別測定20 個花球，黃化指數(shù)按下式進(jìn)行計算，且黃化指數(shù)大于2的樣品被認(rèn)為市場不可接受。

黃化指數(shù)＝∑（黃化級別×黃化樣品數(shù)目比例）

1.3.2.2 葉綠素含量的測定

葉綠素的提取和含量測定參照Lichtenthaler等[13]的方法，并略微改動。精確稱取1.00 g新鮮樣品，液氮研磨后加入50 mL、體積分?jǐn)?shù)80%丙酮溶液提取，低溫避光提取過夜，至材料完全變成無色。提取液過濾后分別在662、645 nm和470 nm波長測定吸光度。

1.3.2.3 可溶性糖含量的測定

可溶性糖含量的測定采用離子色譜法[14]。精確稱取2.000 g樣品，研磨后加入45 mL超純水用超聲波提取30 min，然后定容至50 mL過濾，將過濾后的上清液稀釋10 倍用于葡萄糖、蔗糖和果糖含量分析。離子色譜分析條件為：CarboPacPA10分離柱（250 mmh4 mm）、CarboPacPA10保護(hù)柱（50 mmh4 mm），淋洗液為50 mmol/L NaOH，流速為0.8 mL/min，柱箱溫度為30 ℃；進(jìn)樣體積為25 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)分析采用SPPS 3.0統(tǒng)計軟件。采用One-way ANOVA模式分析，顯著性差異采用Duncan檢驗。葡萄糖含量和黃化指數(shù)相關(guān)性分析采用雙變量Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照處理對鮮切西蘭花貯藏期間葉綠素含量和黃化指數(shù)的影響

由圖1A、B可知，和黑暗對照相比，24 μmol/（m2gs）光照處理顯著增加了鮮切西蘭花貯藏期間葉綠素含量。由圖1A可知，光照處理樣品中葉綠素a含量在貯藏的第1天和第5天分別比黑暗對照樣品高27%和41%。光照條件下，樣品中葉綠素a含量在貯藏第1天顯著增加，且在之后4 d貯藏時間內(nèi)一直維持較高的水平；而黑暗條件下，樣品中葉綠素a含量隨著貯藏時間延長顯著下降，與貯藏初期（第0天）相比，貯藏末期下降了18%。

由圖1B可知，和葉綠素a相似，光照處理樣品中葉綠素b含量在貯藏的第1、5天分別比黑暗對照樣品高43%和27%。光照條件下，葉綠素b在貯藏第1天上升7%，在貯藏第5天下降18%；黑暗對照樣品中葉綠素b含量則在貯藏期間顯著下降，在貯藏第1、5天分別下降了25%和35%。

圖1C表示鮮切西蘭花貯藏過程中葉綠素a含量和葉綠素b含量的比值變化（計作a/b），無論光照處理還是黑暗對照，a/b值均隨著貯藏時間延長上升，光照條件下，a/b值在貯藏第1、5天分別上升了9%和41%，黑暗對照樣品中a/b值則分別上升23%和27%。

由圖1D可知，光照處理顯著影響鮮切西蘭花黃化指數(shù)。隨著貯藏時間的延長，所有樣品均出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，然而，這種黃化現(xiàn)象被光照處理顯著抑制。光照條件下，樣品的黃化指數(shù)在貯藏的第1、5天分別由0增加到0.30和1.10，而黑暗對照樣品的黃化指數(shù)在貯藏的第1、5天則分別由0增加到0.66和1.55。盡管如此，所有樣品在貯藏末期，黃化指數(shù)都小于臨界值2，均為市場可接受。

圖1 光照處理對鮮切西蘭花貯藏期間葉綠素和黃化指數(shù)的影響Fig.1 Effect of fl uorescence irradiation on chlorophyll content and yellowing index of fresh-cut broccoli fl orets during storage

2.2 光照對鮮切西蘭花葡萄糖、蔗糖和果糖含量的影響

圖2 光照對鮮切西蘭花貯藏期間可溶性糖含量的影響Fig.2 Effect of fl uorescence irradiation on soluble sugar content of fresh-cut broccoli fl orets during storage

離子色譜分析結(jié)果表明，蔗糖、葡萄糖和果糖是西蘭花中主要可溶性糖類型，本實驗中所用原料三者含量分別為3.1、4.9 g/kg和2.6 g/kg，明顯低于其他報道[15]，主要可能是使用的原料采前品質(zhì)和測定方法不同所致。光照處理顯著誘導(dǎo)鮮切西蘭花貯藏期間蔗糖、葡萄糖和果糖含量累積（圖2）。由圖2A可知，和黑暗對照相比，光照樣品中葡萄糖含量在貯藏第1、5天分別是黑暗對照樣品的1.95 倍和1.90 倍。光照條件下，樣品中葡萄糖含量在貯藏第1、5天分別比貯藏前（第0天）提高了84%和106%，而黑暗對照樣品中葡萄糖含量在貯藏期間無顯著性變化。

由圖2B可知，和葡萄糖含量變化趨勢非常相似，在光照條件下，蔗糖含量在貯藏第1天顯著升高，在貯藏第1、5天分別增加了100%和73%，黑暗對照樣品中蔗糖含量則在貯藏期間無顯著變化。在貯藏第1、5天，光照樣品中蔗糖含量顯著高于黑暗對照樣品，分別是黑暗對照樣品中蔗糖含量的1.77 倍和1.73 倍。

由圖2C可知，光照處理樣品中果糖含量在貯藏第5天顯著高于黑暗對照樣品。光照條件下，果糖含量在貯藏第1、5天分別增加了51%和70%，黑暗對照樣品中果糖含量在貯藏第1天增加20%，在貯藏第5天又下降到貯藏初期（第0天）水平。

2.3 外源葡萄糖處理對鮮切西蘭花葡萄糖含量和黃化指數(shù)的影響

和其他可溶性糖含量相比，葡萄糖在鮮切西蘭花中含量相對較高，而且對光照處理應(yīng)答積極（圖2）。因此，采用不同濃度葡萄糖溶液對鮮切西蘭花進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明，在一定范圍（0～120 mmol/L）內(nèi)，隨著外源葡萄糖濃度的提高，鮮切西蘭花葡萄糖含量升高，黃化指數(shù)降低（表1）。進(jìn)一步對外源葡萄糖濃度、樣品內(nèi)葡萄糖含量以及黃化指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明外源葡萄糖濃度、樣品中內(nèi)源葡萄糖含量都和黃化指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為－0.958和－0.878（P＜0.01）（表2），說明葡萄糖對延緩鮮切西蘭花衰老黃化具有積極的調(diào)控作用。

表1 葡萄糖處理對鮮切西蘭花7 ℃貯藏5 d后葡萄糖含量和黃化指數(shù)的影響Table1 Effect of exogenous glucose concentration on endogenous glucose content and yellowing index of fresh-cut broccoli fl orets after 5 d storage at 7 ℃

表2 外源葡萄糖濃度、內(nèi)源葡萄糖含量和黃化指數(shù)相關(guān)性分析（n＝15）Table2 Pearson correlations between exogenous and endogenous glucose content and yellowing index (n= 15)

3 討 論

綠色蔬菜在貯藏過程中由于葉綠素降解而導(dǎo)致的組織黃化是其衰老的主要癥狀之一，也是限制其貯運(yùn)與銷售的關(guān)鍵因素[3]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)光照處理能夠增加鮮切西蘭花貯藏期間葉綠素含量，降低其黃化指數(shù)，從而維持產(chǎn)品較好的感官品質(zhì)，相似的結(jié)果在生菜[7,16]、菠菜和芥藍(lán)[16]等綠色蔬菜中也被證實。主要原因可能是采后蔬菜盡管脫離了水分和養(yǎng)分供給，但其仍然是鮮活的生命體，在一定時間內(nèi)能繼續(xù)進(jìn)行生命活動。研究發(fā)現(xiàn)，在合適的光照條件下，采后綠色蔬菜組織在貯藏初期一段時間內(nèi)會進(jìn)行短期的光合作用，合成一定量色素，補(bǔ)充因貯藏衰老而降解的色素[5-6,16]，從而維持較好的感官品質(zhì)。而且光照對采后葉片色素的影響還具有延續(xù)性，即光照處理后的葉片放入黑暗環(huán)境中貯藏，葉片中色素和活性物質(zhì)含量仍然上升或維持[5]。而黑暗貯藏的樣品由于無法進(jìn)行光合作用，不能合成色素物質(zhì)，因貯藏衰老導(dǎo)致的葉綠素降解不能得到補(bǔ)充，因此表現(xiàn)為葉綠素含量下降；另外，研究發(fā)現(xiàn)，光照能夠抑制葉綠素降解相關(guān)酶類活性，減緩葉綠素分解，從而維持植物應(yīng)有的綠色[17]，光照處理主要通過光氧化酶活性中心位點抑制酶活性[4]。

葡萄糖、蔗糖和果糖是綠色植物組織在光照條件下光合作用的主要光合產(chǎn)物。本實驗發(fā)現(xiàn)，光照貯藏樣品中葡萄糖和蔗糖含量均顯著高于黑暗對照樣品，在貯藏第5天光照處理組樣品果糖含量也顯著高于對照組樣品（圖2），說明光照條件下鮮切西蘭花繼續(xù)進(jìn)行光合作用，累積可溶性糖。這與本課題組前期對芹菜[6]和生菜[7]的研究結(jié)果一致。此外，光照條件下，鮮切西蘭花可溶性糖含量在貯藏第1天顯著升高，之后的5 d內(nèi)變化較小，說明鮮切西蘭花在貯藏初期光合作用較強(qiáng)，隨著貯藏時間的延長其光合作用降低或終止，可能的原因是貯藏初期花蕾是新鮮狀態(tài)，葉綠體結(jié)構(gòu)比較完整，光合能力較強(qiáng)，而隨著貯藏期的延長，由于脫離水分和養(yǎng)分的供給，花蕾開始逐漸衰老，導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)破壞，光合能力下降。這一推論也被Charles等[5]證實，其研究發(fā)現(xiàn)，光照條件下，鮮切生菜光合能力和光合效率都顯著高于對照組，隨著貯藏時間延長，其光合能力有所降低。

衰老黃化是限制西蘭花貯運(yùn)保鮮的關(guān)鍵因素。已有資料表明外源可溶性糖能顯著延緩西蘭花衰老黃化，提高其抗氧化酶活性和抗氧化能力[18-19]。本研究也發(fā)現(xiàn)，光照處理能顯著降低鮮切西蘭花黃化指數(shù)，同時誘導(dǎo)其葡萄糖、蔗糖和果糖累積（圖1D、圖2），因此推測光照誘導(dǎo)的可溶性糖累積可能參與調(diào)控鮮切西蘭花衰老黃化進(jìn)程。外源葡萄糖培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，鮮切西蘭花黃化指數(shù)與外源葡萄糖濃度、內(nèi)源葡萄糖含量都呈極顯著相關(guān)性（表2），進(jìn)一步證明葡萄糖累積對鮮切西蘭花衰老黃化有積極的調(diào)控作用，其可能的調(diào)控機(jī)制有以下幾點：1）抑制葉綠素降解：研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖在延緩采后西蘭花褪綠過程中可能通過抑制葉綠素酶與脫鎂葉綠素酶活性從而抑制葉綠素降解[19]，葡萄糖和果糖通過抑制香蕉皮葉綠素b還原酶、脫鎂葉綠素加氧酶的基因表達(dá)從而使其保持綠色[20]。2）維持組織能量水平：眾所周知，糖是植物能量來源，能夠維持植物組織能量水平，能量虧缺會誘導(dǎo)果蔬采后衰老，能量維持則延緩衰老[21]；因此可溶性糖也可能通過維持鮮切西蘭花能量水平延緩其衰老黃化，例如蔗糖可提高西蘭花花蕾中三磷酸腺苷、二磷酸腺苷含量和能荷水平，從而延緩其采后黃化進(jìn)程[22]。3）維持組織抗氧化能力，減緩氧化衰老。葡萄糖能維持采后西蘭花較高的抗氧化酶活性，提高自由基清除能力，從而減緩衰老黃化[19]；事實上，葡萄糖本身也具有抗氧化性，能夠增強(qiáng)植物抗氧化能力，減緩因氧自由基氧化而導(dǎo)致的衰老[23]。4）通過糖信號作用：長期以來，國內(nèi)外研究認(rèn)為糖對采后果蔬衰老和品質(zhì)的調(diào)控主要通過提供能量、呼吸基質(zhì)和調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢等方式進(jìn)行，糖對植物生長發(fā)育、成熟衰老和基因表達(dá)的調(diào)控是糖代謝的結(jié)果；而最新研究發(fā)現(xiàn)，植物中特異的糖信號感知和傳導(dǎo)機(jī)制并不需要糖的分解代謝，啟動糖信號是己糖磷酸化的過程而非磷酸化的糖本身，這一信號的傳遞可在毫摩爾水平上進(jìn)行，也就是說，糖可以作為一種信號物質(zhì)參與植物生長發(fā)育和成熟衰老進(jìn)程中基因表達(dá)的調(diào)控[24-25]。糖信號與其他物質(zhì)如激素等一起形成復(fù)雜的調(diào)節(jié)抗氧化體系網(wǎng)絡(luò)，可清除自由基、保護(hù)細(xì)胞免受損傷、調(diào)控衰老基因表達(dá)等[24-27]。研究表明可溶性糖可作為信號物質(zhì)參與園藝產(chǎn)品采后葉綠素降解、葉片衰老、基因表達(dá)等相關(guān)進(jìn)程的調(diào)控[25]，例如在香蕉采后成熟過程中，葡萄糖和果糖通過依賴己糖激酶（hexokinase，HXK）糖信號途徑調(diào)控采后香蕉果皮葉綠素降解[28]；在牡丹切花花青素苷積累過程中，葡萄糖通過依賴HXK信號途徑調(diào)控與花青素苷含量緊密相關(guān)的基因PsF3’H1的表達(dá)，同時通過不依賴HXK途徑調(diào)控參與類黃酮和花青素苷合成相關(guān)基因PsWD40-2和PsMYB2等表達(dá)[29]；尤其在光照條件下，糖可能作為信號物質(zhì)參與調(diào)控采后菜心葉片衰老進(jìn)程[30]。然而可溶性糖是否通過糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)控鮮切西蘭花衰老黃化尚需進(jìn)一步研究證實。

值得一提的是，在外源葡萄糖培養(yǎng)實驗中，樣品中蔗糖和果糖含量隨著貯藏時間的延長都呈下降趨勢，且含量和黃化指數(shù)無顯著相關(guān)性（數(shù)據(jù)未提供）。盡管如此，蔗糖和果糖仍然可能和葡萄糖具有相似的作用，可參與調(diào)控鮮切西蘭花衰老黃化進(jìn)程。因為這些糖類都是光合作用的主要產(chǎn)物，尤其是蔗糖分解直接水解生成葡萄糖和果糖，這些可溶性糖在采后果蔬衰老進(jìn)程中具有相似或相同的調(diào)控作用，如維持組織能量[22]、調(diào)控葉綠素代謝[19]、降低組織氧化衰老[19,23]、產(chǎn)生糖信號作用[25]、維持滲透壓等。有關(guān)光照誘導(dǎo)的其他可溶性糖如蔗糖和果糖對鮮切西蘭花衰老的調(diào)控作用需要進(jìn)一步驗證。

綜上所述，和黑暗對照相比，24 μmol/（m2gs）熒光間斷照射能夠維持鮮切西蘭花葉綠素含量，降低黃化指數(shù)，誘導(dǎo)可溶性糖累積，外源葡萄糖處理顯著增加鮮切西蘭花葡萄糖水平，降低黃化指數(shù)，鮮切西蘭花組織內(nèi)葡萄糖含量和黃化指數(shù)具有極顯著負(fù)相關(guān)性。由此可見，光照延緩鮮切西蘭花黃化可能與其誘導(dǎo)的可溶性糖尤其是葡萄糖累積有關(guān)，而糖累積對鮮切西蘭花衰老黃化的作用機(jī)制尤其是糖信號作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。