葛念念,周 易,田亞琴,邵遠(yuǎn)志*
(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南 ???570228)
芒果是著名的熱帶水果之一,因果肉細(xì)膩、風(fēng)味獨(dú)特,素有“熱帶果王”之稱,食用芒果具有美化肌膚、預(yù)防高血壓和動(dòng)脈硬化、防止便秘、止咳、清腸胃的功效,深受人們喜愛。芒果以其味美、質(zhì)優(yōu)、營(yíng)養(yǎng)豐富而聞名天下,其含有豐富的糖、蛋白質(zhì)、粗纖維及維生素。芒果是我國(guó)海南、廣東、廣西等多個(gè)地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。但采后病害常會(huì)引起芒果大批量的腐爛變質(zhì),造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。生物防治是近十年來研究最熱、突破性最大的一種控制果蔬采后病害的方法[1]。生物防治方法主要有誘導(dǎo)抗病性、植物源抑菌物質(zhì)和拮抗微生物。自2000年以來,國(guó)內(nèi)外對(duì)微生物誘導(dǎo)果蔬抗病性的研究越來越關(guān)注。Anitha等[2]研究表明,將熒光假單胞菌、木霉菌和水楊酸混合后使用能有效增強(qiáng)水稻對(duì)紋枯病菌的抗病性;范三紅等[3]用拮抗細(xì)菌洋蔥霍爾德氏菌處理采后玫瑰香葡萄后,發(fā)現(xiàn)葡萄的抗病性相關(guān)酶活性有所提高。井敏敏等[4]的研究結(jié)果也表明微生物對(duì)采后芒果果實(shí)的過氧化物酶(peroxidas,POD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine amonialyase,PAL)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,GLU)等酶活性具有一定的誘導(dǎo)作用,同時(shí)還能維持采后芒果的貯藏品質(zhì)。生物防治微生物誘導(dǎo)果實(shí)抗性具有無毒、環(huán)保、無殘留等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于果蔬采前、采后病害的防治。增強(qiáng)微生物誘導(dǎo)果實(shí)抗性、維持果實(shí)品質(zhì)的效力是當(dāng)下研究熱點(diǎn)。
在采后果蔬的生物防治領(lǐng)域,將不同拮抗菌混合或?qū)⑥卓咕c其他物質(zhì)結(jié)合使用是增強(qiáng)拮抗菌生物防治效力的重要手段之一[5-8]。但菌株混合使用對(duì)誘導(dǎo)果蔬抗性效力影響的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室前期獲得的對(duì)采后芒果抗性相關(guān)酶具有有益影響的3 種菌株為研究對(duì)象[9-11],評(píng)估3 種菌株混合使用對(duì)芒果品質(zhì)和抗病性的影響,旨在篩選出一種或多種有效的復(fù)合菌劑用于商業(yè)化生產(chǎn)。
芒果果實(shí)采自海南省昌江縣芒果園,以七成熟、無病蟲害、大小一致的‘臺(tái)農(nóng)’芒果為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii,Y-1)、2.3511號(hào)尼泊爾德巴利酵母(Debaryomyces nepalensis,T18)、萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus,TE-7)由本實(shí)驗(yàn)室前期分離篩選鑒定所得;芒果膠胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。
L-苯丙氨酸、氮藍(lán)四唑、愈創(chuàng)木酚、領(lǐng)苯二酚、3,5-二硝基水楊酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。
CM-700d手持分光測(cè)色儀 日本柯尼卡美能達(dá)公司;FHM-1硬度計(jì)、N-1α手持折光儀 日本Atago公司;UV-1800紫外-可見光分光光度計(jì) 島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司。
1.3.1 孢子萌發(fā)抑制實(shí)驗(yàn)
孢子萌發(fā)率的測(cè)定參照劉星雨[12]的方法并稍加修改。取7 支10 mL離心管,分別加入5 mL 108CFU/mL的TE-7、T18、Y-1、T18+Y-1、Y-1+TE-7、T18+TE-7菌懸液和無菌蒸餾水(對(duì)照),其中各混合菌液中,兩種菌液的體積比均為1∶1。再依次加入用無菌蒸餾水配制的100 μL 105CFU/mL芒果膠胞炭疽病孢子懸浮液,置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),分別在5 h和8 h后用顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。
1.3.2 原料處理
挑選七成熟、大小一致、無病蟲害的臺(tái)農(nóng)芒果,修剪果柄至5 mm左右,用自來水洗去污漬后置于體積分?jǐn)?shù)2%的次氯酸鈉溶液中浸泡2 min,再用自來水將果實(shí)沖洗干凈,晾干后將果實(shí)分為7 組,分別用無菌蒸餾水和108CFU/mL的TE-7、T18、Y-1、T18+Y-1、Y-1+TE-7、T18+TE-7菌懸液浸泡果實(shí)20 min,室溫下晾干。處理后的果實(shí)置于25 ℃、相對(duì)濕度90%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。貯藏21 d后測(cè)定病情指數(shù);品質(zhì)指標(biāo)每3 d進(jìn)行一次取樣測(cè)定。
1.3.3 病情指數(shù)的測(cè)定
將各處理組的芒果按果實(shí)表面病斑的面積所占果實(shí)表面積的比例進(jìn)行分級(jí):0級(jí)(沒有病斑)、1級(jí)(病斑面積<1/10)、2級(jí)(病斑面積占1/10~1/5)、3級(jí)(病變面積占1/5~1/2)、4級(jí)(病斑面積>1/2)。每個(gè)處理20 個(gè)果實(shí),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。病情指數(shù)按下式計(jì)算。
1.3.4 品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定
芒果色澤(紅度a*值)采用分光測(cè)色計(jì)測(cè)定;硬度用FHM-1果實(shí)硬度計(jì)進(jìn)行測(cè)定;可滴定酸(titratable acid,TA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用堿中和滴定法測(cè)定;總可溶性固形物(total soluble solids,TSS)質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用N-1α手持折光儀測(cè)定[13]。以上各指標(biāo)測(cè)定每組處理測(cè)3 個(gè)果實(shí),每個(gè)果實(shí)重復(fù)測(cè)3 次。
1.3.5 PPO、POD、GLU、PAL活力的測(cè)定
多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活力測(cè)定采用鄰苯二酚法[14]。取2 g經(jīng)液氮處理的芒果樣品,加入預(yù)冷的5 mL100 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 7.5,含1 mmol/L聚乙二醇6000、40 mg/mL PVP和10 mg/mL TritonX-100)后,用研缽進(jìn)行冰浴研磨。研磨獲得的酶提取物在4 ℃下以15 000hg離心20 min,取上清液制備反應(yīng)體系。反應(yīng)體系平衡1 min后連續(xù)測(cè)定在398 nm波長(zhǎng)處吸光度的上升段。以1 mg/mL鄰苯二酚溶液作為對(duì)照,以1 min內(nèi)398 nm波長(zhǎng)處吸光度上升0.01為1 個(gè)酶活力單位(U)。單位為U/(ggmin),結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。每組處理測(cè)定3 個(gè)果實(shí),每個(gè)果實(shí)提取的樣液重復(fù)3 次。
POD活力參照王學(xué)奎[15]的方法測(cè)定。取2 g經(jīng)液氮處理的芒果樣品,加入預(yù)冷的5 mL 100 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 7.5,含1 mmol/L聚乙二醇6000、40 mg/mL PVP和10 mg/mL TritonX-100)后,用研缽進(jìn)行冰浴研磨。研磨獲得的酶提取物在4 ℃下以15 000hg離心20 min,取上清液制備反應(yīng)體系。以1 min內(nèi)470 nm波長(zhǎng)處吸光度上升0.01為1 個(gè)酶活力單位。單位為U/(ggmin),結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。每組處理測(cè)定3 個(gè)果實(shí),每個(gè)果實(shí)提取的樣液重復(fù)3 次。
GLU活力測(cè)定參照Ippolito等[16]的方法稍加修改,通過測(cè)量從底物釋放的還原糖的量來測(cè)定。取2 g經(jīng)液氮處理的芒果樣品,加入預(yù)冷的5 mL 50 mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH 5.2,含有1 mmol/L乙二胺四乙酸、5 mmol/L β-巰基乙醇和1 g/L L-抗壞血酸),用研缽進(jìn)行冰浴研磨獲得酶提取物。酶提取物在4 ℃下透析12 h,然后12 ℃、12 000hg離心20 min,取上清液制備反應(yīng)體系。反應(yīng)體系于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以每秒每克鮮果實(shí)組織與昆布多糖反應(yīng)生成1 nmol葡萄糖為1 個(gè)酶活力單位(U),酶單位以U/(ggs)表示。蒸餾水代替酶液作為空白對(duì)照。每組處理測(cè)定3 個(gè)果實(shí),每個(gè)果實(shí)提取的樣液重復(fù)3 次。
PAL活力測(cè)定參考曹建康等[17]方法,稍加修改。取2 g經(jīng)液氮處理的芒果樣品,加入預(yù)冷的5 mL 100 mmol/L硼酸緩沖液(pH 8.8,含40 g/L PVP、2 mmol/L乙二胺四乙酸和5 mmol/L β-巰基乙醇),用研缽進(jìn)行冰浴研磨。研磨獲得的酶提取物在4 ℃下15 000hg離心20 min,取上清液制備反應(yīng)體系。反應(yīng)體系于290 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以每小時(shí)每克鮮果酶促反應(yīng)體系吸光度增加0.01作為1 個(gè)酶活力單位,單位為U/(ggmin)。每組處理測(cè)定3 個(gè)果實(shí),每個(gè)果實(shí)提取的樣液重復(fù)3 次。
數(shù)據(jù)采用Excel軟件處理,Origin Pro 8.0軟件繪圖。使用SPSS 16.0軟件通過單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)進(jìn)行差異顯著性比較,P<0.05表示差異顯著。
如表1所示,處理5 h后所有菌液對(duì)炭疽病病原菌孢子的相對(duì)抑制率為100%。與對(duì)照相比,各菌液處理均能有效抑制病原菌孢子的萌發(fā)。8 h后,Y-1+TE-7處理組的孢子萌發(fā)率最低,僅為17.56%,分別是單一處理組Y-1、TE-7的36%、80%。說明Y-1和TE-7組合后提高了單一處理對(duì)炭疽菌孢子萌發(fā)的抑制率。
表1 不同處理對(duì)培養(yǎng)不同時(shí)間炭疽菌孢子萌發(fā)率的影響Table1 Effect of different treatments on spore germination of Colletotrichum gloeosporioides%
圖1 不同處理對(duì)貯藏結(jié)束時(shí)芒果病情指數(shù)的影響Fig.1 Effects of different treatments on disease index in mango fruit at the end of storage
如圖1所示,芒果貯藏21 d時(shí),Y-1+TE-7處理組的病情指數(shù)僅為10.42,顯著低于其他處理組(P<0.05)。此外,與各自單一處理組相比,T18+TE-7和T18+Y-1組合的病情指數(shù)反而呈現(xiàn)略微上升的現(xiàn)象。
色澤是最直觀的表現(xiàn)果實(shí)品質(zhì)變化的指標(biāo),a*值代表紅綠色度。由圖2A可知,貯藏前期,a*值為負(fù),各組芒果色澤變化差異并不明顯。6 d后,a*值開始呈上升趨勢(shì),且各處理組間差異明顯。在第15天時(shí),Y-1+TE-7處理組a*值最小,僅為-7.10,與此同時(shí),其他處理組果實(shí)皆已不呈現(xiàn)綠色(即轉(zhuǎn)黃)。與各自單一處理組相比,Y-1+TE-7組合能明顯地抑制芒果由綠變黃的顏色,但T18+TE-7和T18+Y-1組合的抑制效果并不理想。
圖2 不同處理對(duì)芒果貯藏期間品質(zhì)的影響Fig.2 Effects of different treatments on storage quality of mango fruit
如圖2B所示,與對(duì)照相比,各菌懸液處理后均能有效延緩芒果貯藏期間硬度的下降。貯藏末期,Y-1+TE-7處理組芒果的硬度高達(dá)0.520 kg/cm2,分別是單一處理組Y-1和TE-7的1.29、1.23 倍。T18+TE-7和T18+Y-1雖有較理想的處理效果,但與T18單一處理相比效果并不明顯。
TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)是衡量果實(shí)成熟度和品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,并常用于果實(shí)的優(yōu)劣分級(jí)。由圖2C可知,貯藏前期(0~9 d),與單一TE-7和Y-1處理相比,Y-1+TE-7處理能更有效地抑制TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)的上升。在第15天時(shí),Y-1+TE-7處理組的TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅達(dá)10.5%,低于其他處理組。在第18天時(shí),處理組Y-1+TE-7的TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速達(dá)到峰值,并在貯藏末期維持較高的TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)。相比單一處理組,T18+TE-7處理組亦能在第12~18天維持著較低的TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)。與對(duì)照相比,T18+Y-1處理也能有效減緩TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)的上升,但其在貯藏末期出現(xiàn)了TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)驟減的現(xiàn)象。成熟后果實(shí)高TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)則表明其具有較好的品質(zhì),故Y-1與TE-7混合后有效增強(qiáng)了各自單一處理對(duì)芒果果實(shí)貯藏期TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)的有利影響(即貯藏前期保持較低的TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù),貯藏后期維持了較高的TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù))。
如圖2D所示,各處理組芒果在貯藏期間TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異明顯。Y-1+TE-7能夠顯著增強(qiáng)各自單一處理延緩TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降的能力(P<0.05);第15天時(shí),Y-1+TE-7處理組的TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)0.95%。而T18+Y-1雖能略提高Y-1單一處理延緩芒果貯藏期TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降的能力,但卻明顯削弱了T18處理延緩芒果貯藏期TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降的能力;T18+TE-7能有效提高Y-1單一處理延緩芒果貯藏期TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降的能力,但其抑制能力卻略低于T18單一處理組。故T18+Y-1、T18+TE-7均未達(dá)到預(yù)想中增強(qiáng)各單獨(dú)處理抑制芒果果實(shí)貯藏期TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降的效果。因此,只有Y-1和TE-7的混合在抑制芒果果實(shí)貯藏期TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降方面表現(xiàn)出協(xié)同作用。
圖3 不同處理對(duì)芒果貯藏過程中相關(guān)酶活力的影響Fig.3 Effects of different treatments on GLU, POD, PAL and PPO activity in mango fruit during storage
GLU是植物抗真菌的重要抗性物質(zhì)之一[18]。如圖3A所示,貯藏期間,各處理組GLU活力均呈先上升后下降的趨勢(shì)。6 d后,Y-1+TE-7處理組GLU活力均顯著高于其他處理組(P<0.05),并在15 d時(shí)達(dá)到最大值(46.20 U/(ggs))。與單一T18處理組相比,T18+Y-1、T18+TE-7組合處理組的GLU活力下降;這表明這兩種組合的菌株在誘導(dǎo)GLU活力方面未能獲得協(xié)同的效果。
POD是多功能酶,是植物酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一,它能與SOD、CAT相互協(xié)調(diào)配合,從而消除過剩的自由基、提高植物的抗逆能力[19]。如圖3B所示,芒果貯藏過程中POD活力大致呈先上升后下降的趨勢(shì)。貯藏6 d后,Y-1+TE-7處理的POD活力整體高于單一處理Y-1和單一處理TE-7的POD活力。第9天時(shí),對(duì)照組和Y-1、TE-7處理組的POD活力分別是23.42、22.56、41.01 U/(ggmin),而Y-1+TE-7的POD活力達(dá)44.67 U/(ggmin);在貯藏后期,TE-7處理組的POD活力開始急劇下降,而Y-1+TE-7處理組仍維持著較高水平的POD活力。結(jié)果表明,Y-1和TE-7組合處理有助于維持芒果POD的高活力。
PAL是苯丙烷途徑的關(guān)鍵酶,植物的抗病力越強(qiáng),PAL活力越高,且高活力持續(xù)的時(shí)間也越長(zhǎng)[20]。如圖3C所示,貯藏6 d后,Y-1+TE-7處理的PAL活力同樣始終高于單一處理Y-1和單一處理TE-7的PAL活力。此外,貯藏3 d后,Y-1+TE-7處理組的PAL活力開始持續(xù)升高,在18 d時(shí)達(dá)到峰值(174.16 U/(ggmin)),分別是此時(shí)對(duì)照組和TE-7、Y-1處理組的2.41、1.53、2.60 倍。T18+TE-7處理組PAL活力第9天時(shí)達(dá)到第一次峰值,僅為此時(shí)TE-7處理組的65%;在第18天達(dá)到第二次峰值時(shí),其酶活力也只達(dá)TE-7處理組的67.4%。T18+Y-1處理組PAL活力僅略高于對(duì)照組,說明兩者組合的效果不佳。因此Y-1和TE-7的組合在提高PAL活力方面表現(xiàn)出了較好的協(xié)同作用,從而能進(jìn)一步增強(qiáng)果實(shí)抗病能力。
PPO是引起果蔬褐變的主要酶類,高活力的PPO會(huì)對(duì)果實(shí)品質(zhì)造成不良影響。如圖3D所示,貯藏期間,各處理組芒果PPO活力均大致呈上升趨勢(shì)。在貯藏中期(9~18 d),Y-1+TE-7處理的PPO活力均低于其他處理組。第6天時(shí),T18+Y-1、Y-1+TE-7處理組PPO活力達(dá)到一個(gè)峰值,分別是此時(shí)對(duì)照組的1.31、1.04 倍。第18天時(shí),T18+Y-1、Y-1+TE-7、T18+TE-7處理組的PPO活力僅是對(duì)照組的79%、64%、88%。貯藏期間,除對(duì)照外,其他處理組均表現(xiàn)出較低的PPO活力,說明所有處理均能有效抑制PPO對(duì)芒果果實(shí)的不利影響。
在抵制病原物侵染的過程中,果蔬體內(nèi)的抗性相關(guān)酶發(fā)揮著重要作用[21-23]。這些酶主要包括病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins,PRs)和苯丙烷代謝中的一些相關(guān)酶。菌株對(duì)植物自身抗病性的影響主要是通過誘導(dǎo)這些酶的活性來實(shí)現(xiàn)的[24-26]。其中POD屬于PR9蛋白家族,不僅可以調(diào)節(jié)活性氧的代謝,還參與木質(zhì)素和植保素的合成,從而增強(qiáng)植物的抗性。精氨酸處理番茄后,誘導(dǎo)了果實(shí)抗病防御相關(guān)酶PAL、POD、GLU和幾丁質(zhì)酶(chitinase,CHT)等活力的提高,促進(jìn)了酚類物質(zhì)的積累,同時(shí)誘導(dǎo)了果實(shí)PR2a、PR2b、PR3a和PR3b的表達(dá)[27]。拮抗菌膜醭畢赤酵母通過誘導(dǎo)草莓PAL、POD、GLU、CHT的活性,從而提高果實(shí)對(duì)灰霉病的抵抗能力[28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與單一Y-1處理和單一TE-7處理相比,Y-1+TE-7處理能顯著提高果實(shí)的GLU、PAL、POD活力,GLU活力提高能加速其對(duì)病原菌細(xì)胞壁的水解,降低病原菌的侵染力;高活性的PAL、POD又可通過調(diào)節(jié)苯丙烷途徑增加木質(zhì)素、酚類、植保素等抗性物質(zhì)的合成;以上說明,相比單一Y-1處理和單一TE-7處理,Y-1+TE-7組合處理更好地誘導(dǎo)了芒果果實(shí)的局部抗性。這一結(jié)果也與Calvo等[29]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用兩種不同的微生物可降低這兩種微生物的變異性并改善兩者單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的作用效力的觀點(diǎn)相一致。
能反映芒果成熟的相關(guān)生理指標(biāo)有很多,如色澤由綠轉(zhuǎn)黃、硬度由硬變軟、TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高和TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與單一Y-1和TE-7處理相比,Y-1+TE-7處理更能延緩芒果TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硬度指標(biāo)的下降,抑制TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高和色澤轉(zhuǎn)黃,同時(shí)維持芒果POD較高的活力,能有效消除果實(shí)貯藏后期氧脅迫對(duì)菌株及果實(shí)本身的不利影響;這一結(jié)果與羅世杏等[30]發(fā)現(xiàn)的SOD、POD的活力與芒果成熟度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)的結(jié)果一致。另有研究表明,成熟度低的果實(shí)具有更高的抗病能力[31-32]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),對(duì)同一成熟度的芒果果實(shí)進(jìn)行不同浸泡處理后,Y-1+TE-7處理組的果實(shí)在貯藏期間表現(xiàn)出了更低的成熟度及更高的抗病性,說明Y-1+TE-7處理可延緩芒果果實(shí)衰老,增強(qiáng)其抗病能力。而其他兩種組合(T18+Y-1、T18+TE-7)的作用效果并不明顯,甚至在有些指標(biāo)上會(huì)表現(xiàn)出削弱單一T18處理的作用效力的現(xiàn)象,這與Stockwell等[33]描述的不同菌株混合后出現(xiàn)的機(jī)械不相容的現(xiàn)象相似。
總地來說,Y-1+TE-7處理對(duì)芒果膠胞炭疽病的孢子萌發(fā)有明顯抑制效果。同時(shí),Y-1+TE-7處理可有效增強(qiáng)各單一處理延緩果實(shí)成熟衰老和誘導(dǎo)POD、PAL、GLU活性的能力,能顯著提高芒果果實(shí)的貯藏品質(zhì)并進(jìn)一步增強(qiáng)果實(shí)的抗病性。由此可見,Y-1+TE-7處理對(duì)采后芒果有良好的保鮮效果,并具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。