彭亞博，李曉婷，方 婷*，李長城*，魏釗異，田裕心，陳沁雯，劉萬寧

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

世界衛(wèi)生組織報告表明，全球每年爆發(fā)的食源性疾病中70%是由致病性微生物污染食品造成的，每年引起的死亡人數(shù)高達(dá)180萬[1]。沙門氏菌污染是食品行業(yè)中重要的公共衛(wèi)生問題，沙門氏菌也是最常見的人畜共患病原體之一，主要引起動物和人類胃腸道疾病[2]。感染沙門氏菌病有幾種不同的途徑，其中95%以上的人類感染病例是由食物引起的[3]。據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心估計，沙門氏菌每年在美國造成約120萬 例疾病，其中23 000 例住院治療，450 例死亡[4]。2015年歐洲食品安全局和歐洲疾病預(yù)防控制中心報道稱，鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌是人類最易感染的血清型，分別占沙門氏菌感染比例的17.4%和44.4%[5]。大多數(shù)感染沙門氏菌的人在感染后12～72 h會出現(xiàn)腹瀉、發(fā)燒和腹部絞痛。這種癥狀通常持續(xù)4～7 d，大多數(shù)人在沒有治療的情況下可以康復(fù)。但是，某些患者可能腹瀉非常嚴(yán)重，需要住院治療。任何人都有可能感染沙門氏菌，但對于老年人和兒童會造成更嚴(yán)重的后果，甚至引發(fā)死亡。

沙門氏菌能在許多食物中存活，如牛肉、雞肉、雞蛋、水果、豬肉、豆芽、蔬菜，甚至如堅果、黃油、冷凍火鍋、餡餅、雞塊等加工食品[6-9]。受污染的食物通?？雌饋砣匀徽＃菚?dǎo)致人感染沙門氏菌繼而患病，對人體造成損傷。雞肉和雞蛋是最常見的人類感染沙門氏菌病的食物載體。沙門氏菌每年造成900多萬 人患病和800 人死亡，其中300萬 人是由雞肉引起的食源性疾病[10]。據(jù)統(tǒng)計，2017年中國雞肉產(chǎn)量和消費量分別占全球雞肉產(chǎn)量和消費量的12.86%和12.15%，居世界第三位[11]。在2009年歐盟爆發(fā)的沙門氏菌疫情中，通過雞肉和雞蛋使人感染沙門氏菌的案例分別占49.1%和5.25%[12]。Yang Baowei等[13]對中國2 個直轄市和6 個城市的調(diào)查結(jié)果顯示，雞肉中沙門氏菌檢出率高達(dá)52.2%。張玉[14]對山東省肉雞中沙門氏菌進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明山東省居民每日因食用肉雞罹患沙門氏菌病的風(fēng)險概率平均值為2.2h10－4，感染沙門氏菌病的人數(shù)為137萬 人/年。

預(yù)測微生物學(xué)以計算機為基礎(chǔ)，描述特定環(huán)境條件下微生物的生長、存活和死亡情況，建立數(shù)學(xué)模型，進(jìn)而為風(fēng)險評估提供依據(jù)。目前國內(nèi)外已經(jīng)有較多關(guān)于各類食品中沙門氏菌生長預(yù)測模型的研究。Fang Ting等[15]研究了4～43 ℃牡蠣中沙門氏菌及背景菌群的動力學(xué)模型，得出Huang平方根模型更適合描述溫度對沙門氏菌生長速率的影響，并得出牡蠣中沙門氏菌的最低和最高生長溫度分別是4.99 ℃和48.05 ℃；而Ratkowsky平方根模型更適合描述溫度對牡蠣中背景菌群生長速率的影響。Huang Lihan等[16]結(jié)合動態(tài)分析方法研究蛋清中沙門氏菌的生長和存活動力學(xué)機制，結(jié)果表明沙門氏菌的最低生長溫度為7.7 ℃，在低于該溫度時沙門氏菌可能會以2.78h10－3（lg（CFU/（mLgh·℃）））的速率死亡。逄海英[17]研究了13、16、25、33 ℃下人工污染的雞肉中沙門氏菌生長變化，結(jié)果表明，Gompertz模型（一級模型）、Arrhenius模型（二級模型）最適合用于擬合沙門氏菌的最大生長速率，其最大生長速率分別為0.072、0.094、0.433、0.527 h－1。美國農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗局進(jìn)行的一項調(diào)查表明，45%的雞肉樣本（25 g）可能被濃度約100.1MPN/g的沙門氏菌感染[18]。而市面上所售雞肉并不是無菌的，其含有一定量種類繁多的背景微生物，可能與沙門氏菌產(chǎn)生競爭關(guān)系，從而影響沙門氏菌在雞肉中的生長。本研究通過一級模型和二級模型來描述8～43 ℃下雞肉中沙門氏菌和背景菌群的生長機制，得到相關(guān)生長參數(shù)，以期為相關(guān)食品監(jiān)管部門開展雞肉樣品中沙門氏菌的風(fēng)險評估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷鮮雞胸脯 永輝超市；鼠傷寒沙門氏菌（CICC22956）、腸炎沙門氏菌（CICC21482） 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

胰酪大豆胨瓊脂（tryptose soya agar，TSA）培養(yǎng)基、腦-心浸出液肉湯、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（xylose lysine desoxycholate agar，XLD） 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；利福平 北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨粉 杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AIRTECH生物安全柜 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Bag Mixer-400均質(zhì)拍打器 法國Interscience公司；H-1850R高速冷凍離心機 湖南相儀實驗室儀器有限公司；SHP-250細(xì)菌生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；KB115低溫恒溫箱 德國BINDER公司；Whirl-Pak-207 mL無菌均質(zhì)袋 美國Nasco公司；VORTEX-5漩渦混合器 上海習(xí)仁科學(xué)儀器有限公司；DX-200高壓滅菌器 德國Systec公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)及接種菌液制備

參照Fang Ting等[15]的方法，活化、培養(yǎng)、誘導(dǎo)和制備沙門氏菌混合接種母液，并通過梯度稀釋使沙門氏菌總數(shù)達(dá)到2～3（lg（CFU/mL）），備用。

1.3.2 雞肉樣品的準(zhǔn)備與接種

在無菌條件下將雞肉分割成（25.0f0.2）g，分裝于無菌均質(zhì)袋中，備用。取上述梯度稀釋的菌懸液100 μL接種到每個均質(zhì)袋內(nèi)的雞肉上，密封，經(jīng)充分混勻后置于一定溫度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 生長實驗與計數(shù)

將已接種的樣品分別放置于8、12、16、20、25、30、33、37、40、43 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照預(yù)設(shè)的時間間隔取樣，在每個樣品中加入20 mL蛋白胨水，用均質(zhì)拍打器正、反兩面分別拍打2 min，用蛋白胨水連續(xù)稀釋每個樣品的液體部分。將適當(dāng)濃度的樣品涂布在TSA/R平板[15]或TSA平板上，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h左右，TSA/R平板用來測定沙門氏菌菌落數(shù)，TSA平板用來測定背景菌菌落數(shù)，其中每個溫度條件設(shè)置10～15 個取樣點。

1.3.4 一級模型的建立

分別采用Huang模型和Baranyi模型作為一級模型來擬合各個溫度下雞肉中沙門氏菌和背景菌群的生長趨勢。其中Huang模型[19]的表達(dá)式如式（1）、（2）所示，Baranyi模型[20]表達(dá)式如式（3）、（4）所示。

式中：Y(t)為t時刻沙門氏菌、背景菌的數(shù)量（lg（CFU/g））；Y0、Ymax為初始菌數(shù)量和穩(wěn)定期菌數(shù)量（lg（CFU/g））；μmax為最大比生長速率/h－1；t為時間/h；λ為延滯期/h；h0反應(yīng)細(xì)菌所處的生理狀態(tài)，h0＝λμmax；α為常數(shù)（4），定義細(xì)菌生長時由延滯后期向?qū)?shù)期轉(zhuǎn)換。

1.3.5 二級模型的建立

分別采用Huang平方根模型[21]、Ratkowsky平方根模型[22]和Cardinal模型[23]評價溫度對雞肉中沙門氏菌和背景菌群生長速率的影響。其中Huang平方根模型的表達(dá)式如式（5）所示，Ratkowsky平方根模型表達(dá)式如式（6）所示，Cardinal模型表達(dá)式如式（7）所示。

式中：Tmin和Tmax分別為最低生長溫度和最高生長溫度/℃；T0為理論最低生長溫度/℃；T為細(xì)菌所處的環(huán)境溫度/℃；μmax為最大比生長速率/h－1；Topt為最適生長溫度/℃；μopt為最適生長溫度下的最適比生長速率/h－1；a、b為常數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究采用預(yù)測微生物學(xué)專用軟件IPMP 2013[30]對雞肉中沙門氏菌及背景菌群的生長數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合處理，并用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞肉中沙門氏菌和背景菌群的生長特點

實驗所用雞肉未經(jīng)過消毒滅菌，天然攜帶一定量的微生物，其菌落數(shù)約為4.72（lg（CFU/g））。每次實驗時，將未接種沙門氏菌組雞肉樣品稀釋，涂布在沙門氏菌選擇性培養(yǎng)基XLD平板上，均未檢測到沙門氏菌。而抗生素抗性沙門氏菌培養(yǎng)物和抗生素選擇性平板（TSA/R）能夠更容易地區(qū)分沙門氏菌和背景菌群[15]。

圖1 8 ℃時雞肉樣品中沙門氏菌和背景菌群的生長曲線Fig.1 Growth curves of Salmonella and background microorganisms in chicken at 8 ℃

沙門氏菌作為嗜溫菌，在8 ℃時生長速率幾乎為零，而背景微生物生長良好并產(chǎn)生完整的生長曲線（圖1）。在12～43 ℃之間，沙門氏菌和背景菌在雞肉中都能正常生長。因此，可以在12～43 ℃之間收集生長數(shù)據(jù)用于數(shù)據(jù)分析。接種的雞肉樣品中沙門氏菌的平均初始菌落數(shù)為2.75（lg（CFU/g）），而背景菌群的平均初始菌落數(shù)為4.72（lg（CFU/g）），比沙門氏菌大約高2 個數(shù)量級。沙門氏菌在此溫度下會與背景菌群展開良性競爭。

圖2 雞肉樣品中沙門氏菌和背景菌群在不同溫度下（12～43 ℃）的生長曲線Fig.2 Growth curves of Salmonella and background microorganisms in chicken at different temperatures (12–43 ℃)

如圖2所示，在生長曲線的穩(wěn)定期期間，背景菌群的平均最大菌落數(shù)為10.29（lg（CFU/g）），比沙門氏菌（8.54（lg（CFU/g）））高近2 個數(shù)量級。在12～43 ℃下獲得的所有生長曲線包括3 個特征階段：延滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期。隨著培養(yǎng)溫度的升高，沙門氏菌和背景微生物延滯期總體上逐漸降低，生長速率逐漸增加。

2.2 一級模型比較分析

目前，國內(nèi)外研究沙門氏菌生長的一級模型大多采用Baranyi模型和修正的Gompertz模型[24-27]。修正的Gompertz模型僅從數(shù)學(xué)角度對細(xì)菌生長進(jìn)行建模，缺乏內(nèi)在的生物學(xué)意義。此外，該方法還可能高估細(xì)菌潛伏期的生長。因此，其逐漸被考慮到細(xì)菌生長生物學(xué)機制的Baranyi模型和Huang模型所取代。如圖2所示，除了8 ℃外，其他實驗溫度所獲得的生長數(shù)據(jù)都可以用Huang模型和Baranyi模型擬合?？梢钥闯觯瑑煞N模型均能較好地擬合雞肉中沙門氏菌和背景菌群的生長狀況，但相比于Baranyi模型，Huang模型中延滯期向?qū)?shù)期轉(zhuǎn)折點和對數(shù)期向穩(wěn)定期轉(zhuǎn)折點更為明顯。統(tǒng)計參數(shù)均方根誤差（root mean square error，RMSE）、均方差（mean square error，MSE）、赤池信息準(zhǔn)則（akaike information criterion，AIC）是衡量模型擬合精確度的重要指標(biāo)，一般來說，其值越小說明模型擬合精確度越高。表1、2列出了2 種一級模型的RMSE、MSE、AIC，總體來說，Huang模型和Baranyi模型的RMSE、MSE、AIC較為接近，無明顯差異，可以認(rèn)為2 種模型對雞肉中沙門氏菌和背景菌群的生長曲線均具有良好的擬合精確度。Juneja等[28]研究了10～45 ℃生牛肉中沙門氏菌生長預(yù)測模型，結(jié)果表明logistic模型、modified Gompertz模型、Baranyi模型和Huang模型均能很好地擬合沙門氏菌的生長，4 個一級模型的擬合精確度并無顯著差異。

表1 雞肉樣品中背景菌群一級模型相關(guān)參數(shù)Table1 Coeff i cients of primary models for the specif i c growth rate of background microorganisms in chicken

表2 雞肉樣品中沙門氏菌一級模型相關(guān)參數(shù)Table2 Coef fi cients of primary models for the speci fi c growth rate of Salmonellain chicken

表 3 兩種模型中沙門氏菌和背景菌群的μmaxTable 3μmax ofSalmonellaand background microorganisms obtained from both models

如表3所示，在12～40 ℃時，Huang模型中沙門氏菌和背景菌群的μmax隨溫度的升高由0.077 h－1和0.094 h－1分別增加到1.580 h－1和1.304 h－1，當(dāng)溫度達(dá)到43 ℃時沙門氏菌和背景菌群的μmax分別下降了0.093 h－1和0.201h－1；Baranyi模型中沙門氏菌和背景菌群的μmax隨溫度的升高由0.090 h－1和0.093 h－1分別增加到1.647 h－1和1.273 h－1，當(dāng)溫度達(dá)到43 ℃時沙門氏菌和背景菌群的μmax分別下降了0.010 h－1和0.072 h－1。

圖3 Baranyi模型和Huang模型 μ max的比較Fig.3 Comparison of μmax between Baranyi model and Huang model

圖3A、B分別比較了由Baranyi模型和Huang模型預(yù)測得到的沙門氏菌及背景菌群的μmax，其回歸方程所代表的直線斜率均接近于1（分別為1.025 2和1.039 6），縱軸截距趨近于0（分別為－0.003 3和－0.019 7），且R2＞0.98，表明由兩種模型估算的沙門氏菌及背景菌群的μmax無明顯差異。這進(jìn)一步證明了2 種模型對雞肉中沙門氏菌和背景菌群的生長曲線均具有良好的擬合能力。

2.3 溫度對沙門氏菌和背景菌群生長的影響

Li Changcheng等[29]研究三文魚魚籽中單增李斯特菌生長動力學(xué)時發(fā)現(xiàn)，Huang模型和Baranyi模型描述單增李斯特菌生長速率無顯著差異，因此將兩種一級模型獲得的生長速率結(jié)合用于評價溫度對沙門氏菌和背景菌群生長的影響。本研究通過兩種一級模型推算出雞肉樣品中沙門氏菌和背景菌群的生長速率也無顯著性差異，因此，可以將雞肉樣品中沙門氏菌和背景菌的生長速率合并用于評價溫度對沙門氏菌和背景菌群生長的影響。圖4、5表明，3 種二級模型（Huang平方根模型、Ratkowsky平方根模型、Cardinal模型）均可以用于描述溫度對雞肉樣品中沙門氏菌和背景菌群生長速率的影響。

圖4 3 種二級模型描述溫度對雞肉樣品中沙門氏菌生長速率影響的擬合曲線Fig.4 Curve fi tting with three secondary models of the effect of temperature on the growth of Salmonella in chicken at selected temperature conditions

圖5 3 種二級模型描述溫度對雞肉樣品中背景菌群生長速率影響的擬合曲線Fig.5 Curve fi tting with three secondary models of the effect of temperature on the growth of background microorganisms in chicken at selected temperature conditions

表4 雞肉樣品中沙門氏菌生長速率的3 種二級模型參數(shù)Table4 Coeff i cients of secondary models for the specif i c growth rate of Salmonella in chicken

表5 雞肉樣品中背景菌群生長速率的3 種二級模型參數(shù)Table5 Coeff i cients of secondary models for the specif i c growth rate of background microorganisms in chicken

表4、5分別列出了沙門氏菌和背景菌群的Huang平方根模型、Ratkowsky平方根模型和Cardinal模型的相關(guān)參數(shù)。根據(jù)表4可知，由Huang平方根模型、Ratkowsky平方根模型和Cardinal模型擬合的雞肉樣品中沙門氏菌的最低生長溫度和最高生長溫度分別是7.810、4.618、5.918 ℃和49.670、52.810、50.553 ℃。Huang Lihan等[16]的研究表明，沙門氏菌最低生長溫度為7.7 ℃左右。Fang Ting等[15]研究表明，沙門氏菌最高生長溫度為48～49 ℃左右。在本研究中，只有Huang平方根模型擬合出的沙門氏菌最低生長溫度和文獻(xiàn)非常接近，Ratkowsky平方根模型和Cardinal模型得到的最低生長溫度均較低。因此，Huang平方根模型可能更適合描述溫度對雞肉樣品中沙門氏菌生長速率的影響。

雞肉樣品中背景菌群的生長也受溫度的影響。與沙門氏菌不同，背景微生物可以在較低溫度（8 ℃）下生長（圖1）。根據(jù)表5可知，由Huang平方根模型、Ratkowsky平方根模型和Cardinal模型擬合的雞肉樣品中背景菌群的最低生長溫度和最高生長溫度分別是2.286、－2.259、－3.122 ℃和44.777、49.930、44.508 ℃。由圖5可知，Huang平方根模型、Ratkowsky平方根模型和Cardinal模型3 種二級模型都可以描述溫度對背景菌群生長的影響。然而，對于種類復(fù)雜的背景菌群來說，Ratkowsky平方根模型可覆蓋的溫度范圍更廣。在雞肉樣品中，沙門氏菌和背景菌群的延滯期受溫度影響較大?？傮w上，隨溫度的升高，延滯期縮短、生長速率增加。Zhou Kang等[25]研究了不同溫度和水分活度下雞肉中沙門氏菌的生長情況，發(fā)現(xiàn)隨溫度升高其最大生長速率增加，延滯期縮短。在Huang模型中，沙門氏菌和背景菌群的延滯期和生長速率之間有如圖6、7所示的對數(shù)線性關(guān)系。

圖6 沙門氏菌一級模型（Huang模型）λ和μmax的相互關(guān)系Fig.6 Correlation between λ and μmax of Salmonella evaluated by the Huang square-root primary model

圖7 背景菌群一級模型（Huang模型）λ和μmax的相互關(guān)系Fig.7 Correlation between λ and μmax of background microorganisms evaluated by the Huang square-root primary model

3 討 論

本實驗研究了8～43 ℃恒溫條件下雞肉樣品中沙門氏菌和背景菌群的生長動力學(xué)模型。沙門氏菌在8 ℃以下生長速率幾乎為零，而背景菌群生長良好。沙門氏菌與背景菌群具有完整的生長曲線，所有曲線都包含延滯期、指數(shù)期和穩(wěn)定期。采用Huang模型和Baranyi模型作為一級模型，綜合分析結(jié)果表明兩種一級模型描述雞肉樣品中沙門氏菌和背景菌群的生長曲線沒有顯著差異。

使用Huang平方根模型、Ratkowsky平方根模型和Cardinal模型作為二級模型分析溫度對沙門氏菌和背景菌群生長速率的影響，結(jié)果表明Ratkowsky平方根模型和Cardinal模型都低估了沙門氏菌的最低生長溫度。而Huang平方根模型可以較準(zhǔn)確地估算出沙門氏菌的最低和最高生長溫度（分別為7.810 ℃和49.670 ℃）。在本研究中，當(dāng)溫度低于8 ℃時，雞肉樣品中的背景菌群生長良好，并有完整的生長曲線。超市出售的雞肉一般放在冰箱里，其背景菌群比較復(fù)雜，可能含有嗜冷菌、嗜熱菌等，嗜冷菌最適生長溫度較低，趨于0 ℃或者低于0 ℃，與Ratkowsky平方根模型擬合出背景菌群最低生長溫度（－2.259 ℃）和最高生長溫度（49.930 ℃）較為符合，故選擇Ratkowsky平方根模型作為背景菌群的二級模型。因此，Huang平方根模型和Ratkowsky平方根模型可以分別作為二級模型描述溫度對雞肉樣品中沙門氏菌和背景菌群生長速率的影響。對于沙門氏菌和背景菌群來說，延滯期和生長速率之間存在對數(shù)線性關(guān)系。

雞肉樣品中的背景菌群可能包括嗜冷菌、嗜溫菌、嗜熱菌等，甚至可能含有競爭性微生物菌群，使沙門氏菌生長受到抑制。據(jù)文獻(xiàn)[31-32]報道，在低溫下沙門氏菌的生長速率低于競爭性微生物中嗜冷菌的生長速率，快速增長的競爭者在低溫下耗盡樣品中的營養(yǎng)物質(zhì)，使沙門氏菌無法達(dá)到在無菌條件下觀察的最大數(shù)量，但在較高溫度下，沙門氏菌的生長速率與競爭性微生物相似或者更高，使沙門氏菌生長的最大數(shù)量更接近無菌食物。在本研究中，圖1、2表明當(dāng)溫度低于20 ℃時，在雞肉樣品中背景菌群比沙門氏菌更適宜生長，溫度高于20 ℃時，兩者最大數(shù)量趨于一致。國外一些學(xué)者將一級模型和二級模型結(jié)合起來建立三級模型，用來預(yù)測食品中競爭性微生物對致病菌生長的影響[33-34]。目前，國內(nèi)對于單一致病菌在食品中的生長模型研究已經(jīng)形成一個較為完整的體系，但是較少考慮到預(yù)測模型中競爭性背景菌群對沙門氏菌生長的影響，本實驗為今后的工作提供了思路。競爭模型是在生長模型的基礎(chǔ)上建立起來的，目前的工作為以后更深入研究微生物菌群之間的生長關(guān)系提供了依據(jù)。本實驗研究了溫度對雞肉樣品中沙門氏菌和背景菌群生長動力學(xué)的影響，并驗證了數(shù)學(xué)模型在預(yù)測微生物生長速率方面的應(yīng)用。食品預(yù)測模型的建立能為食品工業(yè)和監(jiān)管機構(gòu)預(yù)測食品貨架期以及食品中微生物的定量風(fēng)險評估提供科學(xué)依據(jù)。