伍紅年譚詩涵王元清雷雅婷劉瑞連嚴建業(yè)?

（1.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208；3.中南林業(yè)科技大學生命科學與技術學院生物技術與工程實驗室，湖南 長沙 410004；4.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410006）

竹節(jié)參又名白三七、竹節(jié)七、竹節(jié)人參等，系五加科人參屬植物竹節(jié)參Panax japonicusC.A.Mey 的干燥根莖，收載于2015年版 《中國藥典》一部，具有散瘀止血、消腫止痛、祛痰止咳、補虛強壯之功效［1］?，F代研究表明，竹節(jié)參具有保護心肌功能、促進免疫、抗腫瘤、抗驚厥、抗應激和抗氧化等藥理作用；已報道的化學成分有皂苷類、糖類、多炔類、氨基酸、揮發(fā)油無機元素及核苷類［2-3］。

然迄今為止，關于竹節(jié)參相關質量控制研究主要集中于皂苷［4］、多糖［5］及揮發(fā)性［6］成分，尚未見對核苷類成分質量控制相關的研究報道。核苷類成分具有廣泛的生理活性，是生物細胞維持生命活動的基本組成元素，具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調節(jié)、改善細胞代謝、鎮(zhèn)靜中樞神經、抗血小板凝集、抗心律失常和抗驚厥等作用［7］，與竹節(jié)參藥效具有一定關聯性；吳兵等［3］在對竹節(jié)參進行化學成分研究中，首次從中分離得8種核苷類成分；張元杰等［8］認為核苷可能是補益中藥的共同物質基礎，對三七、人參等6種常用的補益藥進行研究，結果表明均含有核苷類。因此核苷可作為竹節(jié)參藥材的質量評價指標之一。

指紋圖譜作為1種多組分復雜樣品的有效質量控制方法，能夠反映出待測樣品的整體性、特征性［9］，結合同時測定多種成分的含有量，被廣泛應用于中藥材和中成藥的質量研究中［10-11］。本研究采用HPLC 法建立了竹節(jié)參核苷類成分的指紋圖譜，結合聚類與主成分分析進行分類分析，并測定其中7種主要成分的含有量，以期為竹節(jié)參質量控制提供依據。

1 材料

Waters e2695 型高效液相儀、Waters 2489 UV檢測器、Empower 3 色譜數據工作站（美國Waters公司）；LE204E／02 型電子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；Option R7 utra AN 超純水系統(tǒng)（英國 Elga Lab Waters 公司）；eppendorf 5424R 高速冷凍離心機；KQ-5200DV 型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。乙腈色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。次黃嘌呤（批號wkq16091402）、尿苷（批號 wkq16083105）、脫氧尿苷（批號 wkq17011101）、肌苷（批號 wkq16090505）、腺苷（批號wkq16092103）、胸腺嘧啶核苷（批號wkq16090903）、鳥苷（批號 wkq16090703）均購買于四川省維克奇生物科技有限公司，含有量均≥98%；10 批不同產地竹節(jié)參樣品，經湖南中醫(yī)藥大學龔力民副教授鑒定為五加科人參屬植物竹節(jié)參Panax japonicusC.A.Mey 的干燥根莖，見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Venusil MP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.01% 甲酸水（B），梯度洗脫（0～15 min，0% A；15～20 min，0%～1%A；20～25 min，1%～3%A；25～55 min，3% A；55～60 min，0% A）；體積流量0.8 mL／min；檢測波長 254 nm；柱溫 30 ℃；進樣量 10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液制備 分別取次黃嘌呤、尿苷、脫氧尿苷、鳥苷、肌苷、腺苷和胸腺嘧啶核苷對照品適量，精密稱定，加超純水制成每1 mL分別含次黃嘌呤 5.60 μg、尿苷 77.59 μg、脫氧尿苷 5.52 μg、肌苷 21.79 μg、鳥苷 80.00 μg、腺苷36.41 μg、胸腺嘧啶核苷 14.00 μg 的溶液，作為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取樣品粉末（過40 目篩）約 1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入 0.1% 氨水 10 mL，稱定質量，超聲提取（40 kHz、250 W）90 min，放冷，再稱定質量，用0.1% 氨水補足減失質量，13 000 r／min 離心10 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 空白溶液制備 0.1%氨水溶液。過濾，進樣，記錄色譜圖。見圖1，空白無干擾。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗 取同一供試品（S10），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6 次，以尿苷為參照峰，測得16 個共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD 介于0.04%～0.30% 及 0.87%～2.99% 之間，均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 重復性試驗 取同一供試品（S10），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液 6 份，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD 介于0.05%～0.61%及0.86%～2.71%之間，表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品（S10），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，于 0、2、4、6、8、10、12 h 在 “2.1”項色譜條件下進樣測定，測得各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD 介于 0.10%～0.89% 及 2.00%～2.88% 之間，表明供試品溶液在12 h 內穩(wěn)定性良好。

2.3.4 指紋圖譜建立 吸取S1～S10 供試品溶液及混合對照品溶液各10 μL，進樣后得到10 批樣品的HPLC 指紋圖譜，見圖2。將所得圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A”進行分析，獲得對照指紋圖譜R，共得到16 個共有峰，將所得對照指紋圖譜與對照品比對可知，確定了其中7 個有峰，分別為次黃嘌呤（5 號峰）、尿苷（8 號峰）、脫氧尿苷（10 號峰）、肌苷（11 號峰）、鳥苷（12 號峰）、腺苷（13 號峰）和胸腺嘧啶核苷（15 號峰）。各批樣品中尿苷的峰面積較大，分離度較好，因此確定其為參照峰S 計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間，結果見表2～3。

圖2 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of ten batches of samples

2.4 相似度分析 將10 批竹節(jié)參色譜圖與對照指紋圖譜相比較，各批次樣品的相似度在0.723～0.978，表明各批次竹節(jié)參樣品的質量相對穩(wěn)定，從圖2 可以看出不同產地竹節(jié)參的化學成分基本一致，各成分在量上存在差異。表4 表明，樣品 S2與S3 相似度相對較低，而其他產地樣品相似度則較高。

2.5 聚類分析 聚類分析是通過將觀察對象依據某些特征加以歸類，從而建立樣本與樣本之間的相似關系或親疏關系的一種探索性數據分析手段，目前已廣泛應用于中藥鑒別、質量評價和品種分類等方面［12］。采用 SPSS 19.0 軟件，以 10 個不同產地的竹節(jié)參藥材的16 個共有峰的峰面積為變量，選用組間聯接法，Euclidean 距離為測度，進行聚類，結果見圖3。表明，當類間距離范圍為 15～25 時，竹節(jié)參藥材可分為3 類，其中S4（四川大涼山）、S5（湖南石門）、S7（貴州貴陽）、S8（湖北神農架）、S9 與 S10（湖北恩施）為Ⅰ類；S1（云南麗江）與S6（江西吉安）為Ⅱ類；S2（四川樂山）與S3（四川雅安）為Ⅲ類。結果表明，竹節(jié)參藥材的指紋圖譜與其地理位置，外界環(huán)境具有一定的相關性，但不絕對相關。

表2 10 批樣品共有峰相對保留時間Tab.2 Relative retention time of common peaks of ten batches of samples

表3 10 批樣品共有峰相對峰面積Tab.3 Relative peak areas of common peaks of ten batches of samples

表4 10 批樣品相似度Tab.4 Similarities of ten batches of samples

2.6 主成分分析 為進一步探討不同產地竹節(jié)參之間的差異，在聚類分析的基礎上，對指紋圖譜數據進行主成分分析。以10 個不同產地的竹節(jié)參藥材的16 個共有峰的峰面積導入SPSS 19.0，對共有峰峰面積進行標準化處理，進行主成分分析。主成分個數提取原則為主成分的特征值大于1 的前m個主成分，表5 表明，前4 個主成分的特征值大于1，即 5.652、3.996、2.004、1.459，對方差的貢獻 率 分 別 為 35.328%、24.976%、12.525%、9.117%，累計貢獻率為 81.946%。表 7 表明，竹節(jié)參的多個成分可以簡化為4 個主成分；圖4 表明前4 個成分較陡，剩余的其他成分之間比較平緩。因前3 個主成分的特征值相對較大，故取前3 個主成分的得分作不同產地竹節(jié)參藥材主成分三維分布圖，見圖5。表明，S4、S5、S7、S8 和 S9 與 S10為Ⅰ類；S1 與 S6 為Ⅱ類；S2 與 S3 為Ⅲ類；其結果與聚類分析一致。

圖3 10 批樣品聚類樹狀圖Fig.3 Dendrogram of ten batches of samples

表5 主成分的初始特征值和貢獻率Tab.5 Initial eigenvalue and contribution rate of princilal component

圖4 各樣品主成分分析碎石圖Fig.4 PCA scree plot of various samples

2.7 含有量測定

2.7.1 線性關系考察 取混合溶液 1、4、8、12、16、20 μL，在 “2.2.1”項色譜條件下進樣，以色譜峰峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X）進行回歸，結果見表 6。

2.7.2 精密度試驗 取 “2.2.1”混合對照品溶液，在 “2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣 6 次，測得次黃嘌呤、尿苷、脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和胸腺嘧啶核苷峰面積RSD 分別為0.41%、0.39%、0.42% 、0.37%、0.39% 、0.36% 、0.48% ，表 明儀器精密度良好。

圖5 不同產地樣品主成分3D 得分圖Fig.5 3D PCA score of samples from different growing areas

表6 各成分線性關系Tab.6 Linear relationships of various constituents

2.7.3 重復性試驗 取同一供試品（S10）6 份，按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下進樣測定，測得次黃嘌呤、尿苷、脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和胸腺嘧啶核苷峰面積的 RSD 分別為 2.13%、2.26%、2.77%、2.88%、2.80%、2.41%、2.47%，表明該方法重復性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品（S10），在“2.1”項色譜條件下，于 0、2、4、6、8、10、12 h 進樣測定，測得次黃嘌呤、尿苷、脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和胸腺嘧啶核苷峰面積RSD 分別 為 2.28%、2.44%、2.92%、2.20%、2.81%、2.43%、2.87%，表明供試品溶液在12 h 內穩(wěn)定性良好。

2.7.5 加樣回收率試驗 取 “2.3.3”項下已測知核苷含有量的樣品6 份，每份約0.5 g，精密稱定，精密加入次黃嘌呤、尿苷、脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和胸腺嘧啶核苷各對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下進樣測定。結果次黃嘌呤、尿苷、脫氧尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和胸腺嘧啶核苷的回收率分別為 98.66%（RSD = 2.69%）、96.90%（RSD =2.92%）、93.34%（RSD=2.97%）、94.86%（RSD=2.82%）、98.60%（RSD=2.73%）、92.74%（RSD=2.66%）、97.95%（RSD=2.31%）。

2.7.6 樣品含有量測定 吸取 “2.2.1”、“2.2.2”項下對照品溶液和S1～S10 供試品溶液各10 μL，在 “2.1”項色譜條件下進樣，按外標法計算含有量，結果見表7。

表7 各成分含有量測定結果（μg／g， n=3）Tab.7 Results of content determination of various constituents（μg／g， n=3）

2.8P值分析 為了探究各產地之間的質量波動，引用1 個易于計算和可見的參數（P值），對不同產地的藥竹節(jié)參藥材質量進行評價，計算公式為其中Ci表示給定化合物的測定濃度，而Ci表示10 個不同產地竹節(jié)參的平均濃度。P值越接近1，批間的一致性越好。一般來說，在0.75～1.25 的范圍內的值是可以接受的［13］，見圖 6，從中觀察到3 個異常值，即峰5（次黃嘌呤）、峰10（脫氧尿苷）和峰11（肌苷）。異常值是導致竹節(jié)參樣品質量波動的重要因素。表明次黃嘌呤、脫氧尿苷、肌苷在樣品中存在較大的波動，對竹節(jié)參的質量有較大影響。

圖6 不同產地樣品7種成分Box-chart 圖Fig.6 Box chart of seven compounds of samples from different growing areas

3 討論

3.1 條件優(yōu)化 由于核苷類成分極性較大，且有些核苷類成分（如次黃嘌呤、鳥苷）在水中的溶解度較差，在堿性溶劑中溶解度較好［14-15］，所以考察了不同極性與不同pH 的提取溶劑（超純水、10% 甲醇水、20% 甲醇水、10% 乙醇水、0.1% 氨水、1%氨水、1%醋酸水、0.1%醋酸水）；不同提取方式（超聲、回流）；不同提取時間（30、45、60、90、120 min）對提取效率的影響。結果發(fā)現，采用0.1%氨水提取效率優(yōu)于其他，且結果穩(wěn)定；超聲提取和回流提取的效果無明顯差異，但超聲提取法處理簡單，重復性好；提取時間90 min 較適宜；因此選擇0.1%氨水超聲提取90 min 為供試品溶液的制備方法。

鑒于核苷類成分為偏堿性的水溶性成分，本實驗考察了各種流動相后發(fā)現，使用乙腈-0.01% 甲酸水流動相時分離度較好，峰形對稱；比較柱溫對峰形的影響，考察了25、30、35 ℃ 3種不同溫度，發(fā)現隨著柱溫的升高與降低，對其峰形都有較大影響，其中30 ℃下影響最小，選為本實驗柱溫；在其他色譜條件一致的情況下，分別對0.5、0.8、1 mL／min 3種體積流量進行考察，結果表明0.8 mL／min最好。

3.2 結果分析 本研究選取不同產地竹節(jié)參藥材作為研究對象，建立了HPLC 指紋圖譜及7種指標性成分含有量測定的方法，完成了在同一色譜圖下對竹節(jié)參核苷類成分定性及定量分析的雙重目的。由10 批樣品指紋圖譜可知，各共有峰相對保留時間差異較小，而相對峰面積差異則較大，表明不同產地竹節(jié)參樣品中化學成分在量上存在較大差異。綜合相似度評價、聚類分析和 PCA 分析結果，將四川大涼山、湖南石門、貴州貴陽、湖北神農架和恩施聚為Ⅰ類；云南麗江、江西吉安聚為Ⅱ類；四川樂山和雅安聚為Ⅲ類。為了進一步了解不同產地竹節(jié)參藥材中核苷類成分的含有量的差異來源，對竹節(jié)參樣品多指標性成分進行定量分析，并結合1個易于計算和可見的參數P進行分析，得到次黃嘌呤、脫氧尿苷、肌苷在樣品中存在較大的波動，對竹節(jié)參的質量有較大影響。本實驗建立了竹節(jié)參核苷類指紋圖譜研究方法，該方法簡便、重復性好，能夠較好地識別竹節(jié)參中核苷類化學成分，監(jiān)測指標性成分含有量的同時，又對樣品整體進行了表征，對評價竹節(jié)參的質量具有參考意義。